劉 悅，曲 浩，李友勇，段志芬，楊盛美，尚衛(wèi)瓊，矣 兵，楊興榮，孫雪梅，劉本英

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，云南省茶學(xué)重點實驗室，云南 勐海 666201）

茶樹（Camellia sinensis）是被子植物山茶科的成員，葉片用于生產(chǎn)多種茶葉[1]。茶是世界上最受歡迎的飲料之一，它含有許多次級代謝產(chǎn)物，使得茶葉具有豐富的味道，并且對人類健康有益處[2]。因為茶樹的性狀和應(yīng)用非常多樣化，得以在世界范圍內(nèi)廣泛栽培[3]。在長期自然雜交和人工選擇壓力下，茶樹芽葉的顏色變得非常豐富[4]，是茶感官評價中的重要組成部分。中國具有豐富的茶樹種質(zhì)資源，除了常見的濃綠色芽葉以外，還有黃綠、紅褐和紫褐色等其他顏色。紅芽直立茶（Camellia assamica cv.Hongya zhili tea）是云南特有的茶樹種質(zhì)資源，原產(chǎn)于云南景谷，其典型特征為大葉，芽葉深紫紅色，莖紫紅色，花青素含量高。紅芽直立茶和紫色芽、莖、葉的“紫鵑”相類似，但紫色的葉子不會隨著葉片的生長和發(fā)育而逐漸變綠[5]，可以一直保持紫色。這些茶樹品種是生產(chǎn)具有特定顏色和風(fēng)味的獨特茶葉的寶貴材料，對未來整個茶業(yè)都是有利的。

植物葉片具有各種顏色是色素積累的綜合結(jié)果，植物中普遍存在的色素包括葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮[6]?；ㄇ嗨貙儆陬慄S酮化合物，到目前為止，已經(jīng)在許多水果、蔬菜和花卉中發(fā)現(xiàn)了超過635種花青素[7]，是植物科學(xué)中研究最多的化合物之一，其代謝途徑已被多次描述?；ㄇ嗨匮苌镏械娘w燕草色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素是植物紫色和深色的來源，而矢車菊色素和天竺葵色素是鮮紅色果實中的主要色素[8]?；ㄇ嗨夭坏梢允谷~色發(fā)生變化，還可以導(dǎo)致生理生化過程的改變[4]，例如增加植物的抗性?；ㄇ嗨乜杀Ｗo(hù)植物免受各種生物和非生物脅迫，包括冷脅迫[9]、鹽脅迫[10]和低磷脅迫[11]。茶樹紫色葉中的花青素具有多種與健康相關(guān)的生物功能，如作為抗氧化劑、抗菌劑[12]和降低血脂[13]。因此，紫芽茶樹是茶樹育種中的重要資源，目前已經(jīng)選育出許多具有紅紫色芽葉的茶樹品種，例如“武夷奇種”[14]、“紫鵑”[5]和“紫燕”[15]。

盡管已經(jīng)鑒定出了幾種與花青素生物合成和調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，但是對每種花青素生物合成途徑調(diào)控的機(jī)制仍然不是很清楚。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使得利用大規(guī)?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)集對花青素生物合成及其調(diào)控基因的功能研究成為現(xiàn)實。RNA測序（RNA-Seq）的易用性和高效性有助于研究代謝物變異的機(jī)制，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已成功應(yīng)用于研究植物代謝機(jī)制[16]和基因在組織發(fā)育過程中的調(diào)控功能[6]。本研究中，我們在轉(zhuǎn)錄組水平上分析了同一株茶樹上兩種不同顏色葉片之間的差異表達(dá)基因及其功能，探索茶樹紫色葉中花青素和類胡蘿卜素的生物合成及其調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果增加了我們對茶樹紫色葉中與色素積累相關(guān)的生物合成基因和相關(guān)調(diào)節(jié)因子的理解，對未來特色茶樹品種的選育具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的實驗材料為紅芽直立茶的一芽三葉，采集于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國家種質(zhì)大葉茶樹資源圃（勐海）。在同一株茶樹上分別采摘紫色和綠色的茶葉，用錫紙包好之后立即放入液氮速凍，-80℃冰箱保存。每種樣品準(zhǔn)備3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 建庫測序

使用 TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分別提取每個樣品的總RNA。使用DNaseI處理檢測合格后的總RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集其中的mRNA，將mRNA打斷后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Illumina TruSeq RNA樣品制備試劑盒第2版（Illumina，San Diego，CA，USA）制備RNA-seq配對末端文庫。使用Illumina HiSeq 4000測序平臺完成測序，建庫測序在北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3 新基因預(yù)測

使用cufflinks（2.2.1）軟件組裝新的轉(zhuǎn)錄本，再利用cuffmerge對多個樣品的組裝結(jié)果進(jìn)行合并，并過濾可能為人工引入的組裝錯誤的轉(zhuǎn)錄本生成唯一注釋文件供后續(xù)差異分析使用。Cuffcompare將組裝的轉(zhuǎn)錄本根據(jù)與參考文件在基因組上的位置關(guān)系分為十二類，其中classcode為u（未知的，基因間區(qū)的轉(zhuǎn)錄本）即認(rèn)定為新基因。以Length>=200bp且exon number>=2作為可靠的新基因篩選條件，并對新基因進(jìn)行功能注釋。

1.4 基因表達(dá)與富集分析

首先對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除含有接頭和低質(zhì)量的序列。使用Tophat 2（2.1.1）軟件將clean reads比對到茶樹的參考基因組[1]上，統(tǒng)計每個樣品中每個基因比對到其位置上的read count數(shù)目，并計算其FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）值。使用edgeR軟件分析紫色和綠色葉中的基因表達(dá)差異，然后使用R程序中的GOseq包對差異基因 （DEGs）進(jìn)行GO富集分析，使用KOBAS（2.0）對DEGs進(jìn)行Pathway富集分析，同時使用超幾何分布檢驗的方法分析富集的顯著性。

1.5 RT-qPCR驗證

通過熒光定量PCR（RT-qPCR）對RNA-seq的結(jié)果進(jìn)行驗證，對每個顏色的三個生物學(xué)重復(fù)的樣本都進(jìn)行PCR，且每個樣品都進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)。使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，通過TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾德萊）和SYBR Green I進(jìn)行qPCR反應(yīng)，所使用的qPCR儀為qTOWER2.2型熒光定量PCR儀。通過茶樹的肌動蛋白基因（actin）作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt的方法計算每個基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序

為了解茶葉顏色多態(tài)性的分子基礎(chǔ)，將紫色和綠色葉共6份樣品（每個3個生物學(xué)重復(fù)）進(jìn)行高通量測序。紫色葉轉(zhuǎn)錄組測序共得到141,279,238條高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，綠色葉共得到130,780,196條高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。高質(zhì)量數(shù)據(jù)均超過6G，來自配對末端讀數(shù)的Q20百分比（測序錯誤率＜1%的序列百分比）均在98%以上，Q30都不低于94%（表1），說明各樣品的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好、可信度高，能滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的需求。測序得到的clean data上傳至NCBI的SRA（Short Read Archive）數(shù)據(jù)庫，獲取號為SRP189546。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計Table 1 Quality statistics of cleandata

2.2 不同顏色茶葉差異表達(dá)基因

為了分析不同顏色茶葉中的差異基因，我們首先對所有基因進(jìn)行定量。然后使用FDR＜0.05且|log2FC|>1作為差異基因（DEG） 的篩選條件，以綠色葉為對照，在紫色葉中一共有8779個基因是差異表達(dá)的，其中有6936個基因上調(diào)，1843個基因下調(diào)（圖1A）。分別從紫色和綠色的葉片中選取表達(dá)量最高的50個基因進(jìn)行基因表達(dá)模式分析，從圖1B中可以看出，這些基因的表達(dá)模式分為兩種。紫色葉中的基因與綠色相比，大多數(shù)基因的表達(dá)量上調(diào)?；跇?biāo)準(zhǔn)基因名和同義詞在差異基因的功能中進(jìn)行搜索，分析與植物色素積累有關(guān)的三個代謝途徑（類黃酮生物合成，花青素生物合成，黃酮和黃酮醇生物合成途徑）的差異基因（表2）。

圖1 紫色和綠色葉中差異表達(dá)的基因Fig.1 Differentially expressed genes in purple and green leaves

表2 與茶葉色素積累相關(guān)的候選基因Table 2 Candidate genes related to tea pigment accumulation

2.3 差異表達(dá)基因的功能富集

得到差異基因之后，對差異基因進(jìn)行GO和KEGG Pathway富集分析。如圖2所示，GO數(shù)據(jù)庫把基因的本體分為三種：物過程（Biological Process,BP）、細(xì)胞組成（Cellular Component,CC）和分功能（Molecular Function,MF）。紫色葉與綠色葉比較，富集到差異基因數(shù)目最多的是分子功能，富集到差異基因數(shù)目最多的功能是結(jié)合與催化活性，其中尤其與糖基水解酶活性、葡萄糖苷酶活性和氧化還原酶活性相關(guān)的功能富集最顯著（表3）。富集到生物過程的差異基因主要集中在細(xì)胞過程和代謝過程中，其中最顯著富集的功能集中在細(xì)胞生長、碳水化合物代謝和激酶活性三方面。我們還注意到其中的GO:0043473、GO:0043476、GO:0043478、GO:0043479和GO:0043480五條term都屬于組織中色素積累過程（表3）。

2.4 黃酮和花青素代謝對茶葉顏色的調(diào)控

圖2 差異基因GO功能二級分類統(tǒng)計Fig.2 Secondary classification statistics of GO function of differential gene

表3 顯著富集的GO條目Table 3 GO items of significant enrichment

通過KEGG pathway富集分析，紫色葉與綠色葉相比，富集到的通路主要有氨基糖和核糖代謝、黃酮代謝、次級代謝產(chǎn)物生物合成，代謝途徑，苯丙烷類生物合成、淀粉和蔗糖代謝（圖3A）。以富集到的黃酮代謝和花青素合成途徑為基礎(chǔ)，結(jié)合文獻(xiàn)構(gòu)建花青素在茶葉中的合成路徑（圖3B），以期找出調(diào)控茶葉顏色變化的關(guān)鍵基因。對途徑中的核心基因進(jìn)行了詳細(xì)分析，結(jié)果表明大多數(shù)基因的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，無論它們是早期基因（查爾酮異構(gòu)酶CHS等）還是晚期基因 （花青素合酶ANS，葡糖基轉(zhuǎn)移酶UFGT等），它們在紫色葉中的基因表達(dá)豐度均高于綠色葉（圖3C）。這些化合物和花青素的生物合成共有的常見酶促步驟由查爾酮合成酶（CHS），黃烷酮3'-羥化酶（F3'H），類黃酮3'5'-羥化酶（F3'5'H）等催化。眾所周知，CHS催化花青素生物合成的第一反應(yīng)，并有助于形成中間體查爾酮，這是所有類黃酮的主要前體。二氫黃酮還原酶（DFR）催化二氫黃酮醇生成各種無色的花色素，是花青素合成過程中的關(guān)鍵酶，ANS催化無色花青素變成有顏色的花青素，UFGT使花色苷的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。在花青素生物合成過程中涉及的所有基因中，有6個CHS、1個DFR、2個F3'5'H和2個ANS基因在紫色葉中的表達(dá)量顯著上調(diào)。通過甲基化、酰基化、羥基化與糖基化等方式對植物中的花青素碳骨架進(jìn)行修飾，不同的修飾反應(yīng)可以形成不同的花青素?；ㄇ嗨靥腔D(zhuǎn)移酶（GT）決定了糖基的位置，在茶葉中主要是第3位糖基化的修飾酶UFGT（3GT），這也是共有的修飾步驟。與綠色葉相比，這也是花青素生物合成途徑中唯一一個出現(xiàn)下調(diào)的基因，說明紫色葉中的花青素糖基化可能受到了抑制。

2.5 類胡蘿卜素生物合成與茶葉紅色和黃色色素的積累

類胡蘿卜素在植物中具有重要的生物學(xué)意義，β-胡蘿卜素在深色的植物中廣泛存在。八氫番茄紅素是植物中的第一個類胡蘿卜素，經(jīng)過八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和ζ胡蘿卜素脫氫酶 （ZDS）等酶經(jīng)過多步反應(yīng)催化脫氫后形成番茄紅素。番茄紅素經(jīng)ε-環(huán)化酶（lcyE）作用形成δ-胡蘿卜素，再經(jīng)lcyB催化形成α-胡蘿卜素。番茄紅素還可以通過β-環(huán)化酶（lcyB）作用形成β-胡蘿卜素，進(jìn)而通過β-環(huán)羥化酶 （LUT5）催化形成β-隱黃質(zhì)和玉米黃素，玉米黃素又在玉米黃素環(huán)氧化酶（ZEP）的催化下形成環(huán)氧玉米黃素和紫黃質(zhì)（圖4A）。在茶葉中發(fā)現(xiàn)許多編碼類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵酶基因，如PDS和lcyB在紫色葉中都是下調(diào)的，而LUT5是上調(diào)的，九順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）的多個拷貝上調(diào)與下調(diào)現(xiàn)象均有存在 （圖4）。PDS和lcyB基因在紫色葉中的下調(diào)表明番茄紅素的合成受到抑制，LUT5的上調(diào)則說明β-胡蘿卜素的分解加強了，可以推測紫色葉中含有較低的番茄紅素和β-胡蘿卜素。在紫色葉中下調(diào)的ZEP和NCED之間的平衡表明紫黃質(zhì)的減少，這些變化說明紫色葉的變黃衰老過程得到減緩。

圖4 茶葉中類胡蘿卜素生物合成及其關(guān)鍵基因Fig.4 Carotenoid biosynthesis and its key genes in tea

2.6 茶葉中基因表達(dá)水平的驗證

以茶樹的肌動蛋白基因actin作為內(nèi)參基因，對參與茶樹黃酮和類胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因CSA004930（F3H）、CSA011508（ANS）、CSA018076（UFGT）、CSA003404（ NCED）、CSA029707（CHI）、CSA024718（CHS）和CSA031792（F3'5'H）進(jìn)行了驗證。使用2-ΔΔCt計算qRT-PCR的結(jié)果，驗證的7個基因中，紫色葉和綠色葉相比，有5個上調(diào)，2個下調(diào)（圖5），與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組中高度一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

3 討論

圖5 差異表達(dá)基因的QRT-PCR結(jié)果Table 5 Verification of the expression level of key genes in tea

紫色茶葉中富含花青素等黃酮類化合物，高濃度黃酮類化合物的茶產(chǎn)品對于人體健康有益。近年來，很多研究者開始探索富含花青素的茶葉品種[17-18]。茶葉的品質(zhì)受到茶樹顏色的影響，特殊顏色的茶樹由于其所含有的生化成分而受到廣泛關(guān)注。黃酮類化合物被認(rèn)為是茶產(chǎn)品中最重要的品質(zhì)參數(shù)，他們決定了茶產(chǎn)品的顏色和味道。兒茶素是導(dǎo)致澀味和苦味的主要原因[19]，而花青素可以與兒茶素和茶黃素結(jié)合[20]。相比于綠色茶葉，紫色茶產(chǎn)品具有獨特的口感和甜味。

本研究通過比較紫色和綠色葉在轉(zhuǎn)錄水平的差異，分析紫色葉中與花青素和類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)變化，揭示不同顏色茶葉形成的機(jī)制。已經(jīng)有很多研究報道了紫葉茶品種的葉片化學(xué)組成和顏色形成的分子機(jī)制。紫色葉的形成與色素的代謝密切相關(guān)，植物組織的顏色主要由葉綠素、類胡蘿卜素和黃酮化合物三種主要的色素決定[16]。黃酮類化合物通常是導(dǎo)致葉片呈紅色、藍(lán)色和紫色的原因，當(dāng)黃酮的含量比較高，足以掩蓋葉綠素的顏色時葉片就會變?yōu)槠渌伾玔21]。在之前的研究中，發(fā)現(xiàn)紫色葉中的花青素和總黃酮含量比綠色葉高很多[5]。

我們通過通路富集找到了類黃酮/花青素生物合成過程中的一些關(guān)鍵基因，這些基因在紫色葉中的表達(dá)水平顯著高于綠色葉，推測黃酮類化合物很可能與茶樹紫色葉的形成有密切聯(lián)系。在紫色葉中花青素合成相關(guān)的基因CHS、CHI、F3H和F3'5'H等表達(dá)量顯著上調(diào)。這些基因的表達(dá)可能會導(dǎo)致黃酮類/花青素生物合成途徑中的代謝物的積累，如矢車菊色素-3葡萄糖苷、飛燕草色素-3-葡萄糖苷和天竺葵色素-3-葡萄糖苷，會導(dǎo)致這些產(chǎn)物在紫色葉中保持較高水平。而代謝組研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類/花青素生物合成途徑中的代謝物在紫葉中保持高水平，而卟啉、葉綠素代謝和類胡蘿卜素生物合成的中間體在綠葉中表現(xiàn)出高水平[22]。這和我們轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步揭示了茶樹品種葉色變化的機(jī)制。

我們發(fā)現(xiàn)5個UGT75L6基因在紫色葉中表達(dá)下調(diào)，1個基因表達(dá)上調(diào)。之前在梔子花中色素積累研究發(fā)現(xiàn)，UGT75L6的表達(dá)量與果實中色素積累并無顯著相關(guān)性[23]。UGT基因是糖基轉(zhuǎn)移酶家族，負(fù)責(zé)將糖部分連接到多種受體底物上，包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和次級代謝物[24-25]。UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶利用高度特異性的糖供體以及糖受體[26]，UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶是花青素和黃酮醇生物合成中的最終酶。在78個UGT家族基因當(dāng)中，UGT78G1和UGT78D2參與到了花色素、黃酮醇、黃酮及異黃酮的生物激活，并且參與花青素的糖基化[27-28]。而另一種UGT78A14的研究中，發(fā)現(xiàn)它參與了黃酮醇-3--O-葡萄糖苷的生物合成[29]。值得一提的是，一種新發(fā)現(xiàn)的UGT72AM1在紫色茶葉中有更高的表達(dá)量，而且在酶測定實驗中證實UGT72AM1具有花青素 -3-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性[30]。UGT75L6屬于次生代謝產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶（PSPGs），有研究報道，UGT7516最有可能位于葉綠體中[23]。在紫色葉中，葉綠素含量下降，我們推測可能和UGT7516基因表達(dá)量下調(diào)存在關(guān)聯(lián)。我們的研究表明，UGT75L6在紫色葉中大都表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。我們推測UGT75L6基因表達(dá)與花青素積累無明顯關(guān)聯(lián)，而且在紫色葉中，UGT75L6的表達(dá)受到抑制。這可能表明UGT75L6沒有花青素-3-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶活性。

黃酮類化合物在植物抵抗寒冷、干旱和UV-B輻射等逆境中發(fā)揮著重要作用，同時對植物的生長起著調(diào)節(jié)作用[31]。茶葉中較高含量的黃酮類化合物可以保護(hù)茶葉免受高光損傷和其他不利的環(huán)境壓力，使得紅芽直立茶具有良好的抗性，可以作為茶樹育種的重要資源。在之前的研究中已經(jīng)克隆了許多參與花青素代謝途徑的基因，并且已經(jīng)報道了這些基因的表達(dá)模式與積累的花色素苷之間的關(guān)系[5]。通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定到了浙江紅花山茶花中與花青素代謝相關(guān)的9個基因，包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮合成酶（CHS）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）和二氫黃酮醇還原酶（DFR）[32]。通過對CHS和F3H表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了它們的表達(dá)水平在“紫鵑”茶的嫩葉中顯著高于老葉[33]。這些研究證實了黃酮生物合成過程中的關(guān)鍵基因?qū)ㄇ嗨胤e累的重要性。

類胡蘿卜素是植物中另一種重要的天然色素，在植物光合作用和對外界的響應(yīng)方面具有重要作用[34]。同時具有光保護(hù)和清除自由基的作用，是植物光合速率和營養(yǎng)情況的重要指標(biāo)[35]。人們普遍認(rèn)為核心類胡蘿卜素途徑在大多數(shù)植物物種中是保守的，然而不同的植物中類胡蘿卜素的積累具有其特性。植物中類胡蘿卜素代謝合成調(diào)控非常復(fù)雜，從茶葉轉(zhuǎn)錄組的角度來看，紫色葉中類胡蘿卜素的積累是受限的。代謝組研究也表明，綠色茶葉中類胡蘿卜素生物合成中的中間體含量較高，而在紫色茶葉中含量較低[30]。從轉(zhuǎn)錄組研究來看，類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵基因 PDS、lcyB、ZEP和NCEN等都在綠色茶葉中表達(dá)更高。

之前研究顯示，類胡蘿卜素可以作為在花青素/黃酮類含量降低時的補充，綠葉中的類胡蘿卜素有助于確保有效的光合作用，清除各種活性氧[36]，并保護(hù)葉綠素免受光氧化作用[37]。所以類胡蘿卜素的升高也有助于保持葉綠素含量，這是造成葉片顯示綠色的原因之一。此外，植物中類胡蘿卜素的合成受到多方面的影響，茶葉中類胡蘿卜素的分解主要是通過9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NECD）來完成的，它是控制類胡蘿卜素向脫落酸（ABA）轉(zhuǎn)化的限速酶[38]。ABA是重要的植物激素，可以抑制細(xì)胞分裂，促進(jìn)葉片的衰老和脫落。紫色葉和綠色葉相比，編碼NECD的5個同源基因的表達(dá)量有3個是降低的，并且紫黃質(zhì)的合成也受到抑制，說明紫色葉中的ABA的合成不足，紫色葉具有更強的抗老化能力。