李貞霞，陳倩倩,，唐金磊，李清艷，張學(xué)禮

1 河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

3 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

番茄紅素是類胡蘿卜素的一種，具有強(qiáng)抗氧化性和極強(qiáng)的清除自由基的能力[1]，對(duì)防治前列腺癌、肺癌、乳腺癌等有很好的療效，能有效抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散[2-4]。番茄紅素除了用于生產(chǎn)保健食品和藥品外，還能添加到冰淇淋、蛋糕等食品中，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具有巨大的市場(chǎng)需求。微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然番茄紅素不受光照、氣候、產(chǎn)地等條件的限制，且產(chǎn)品具有經(jīng)濟(jì)、安全等優(yōu)勢(shì)，因此該技術(shù)受到國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的廣泛青睞。

番茄紅素等萜烯類化合物合成的前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)，可以經(jīng)甲羥戊酸途徑 (MVA途徑) 和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑) 兩條途徑合成 (圖1)。近年來對(duì)重組大腸桿菌提高番茄紅素產(chǎn)量的改造主要集中在提高M(jìn)EP途徑關(guān)鍵基因表達(dá)、引入外源MVA途徑基因提高前體物質(zhì)供應(yīng)方面。另外，近年來部分研究組通過代謝流分析等研究了非代謝途徑基因表達(dá)水平對(duì)萜類化合物產(chǎn)量的影響[5-9]。Alper等利用代謝流分析，驗(yàn)證了敲除谷氨酸脫氫酶基因 (gdhA)、丙酮酸脫氫酶基因 (aceE)、轉(zhuǎn)醛醇酶基因 (talB)、甲酸脫氫酶基因 (fdhF) 對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)同時(shí)敲除gdhA、aceE和fdhF，產(chǎn)量提高37%[5]。Choi等發(fā)現(xiàn)高表達(dá)磷酸果糖激酶基因(pfkA)、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因 (pgi)、果糖-二磷酸醛縮酶Ⅱ基因 (fbaA)、磷酸甘油醛異構(gòu)酶基因 (tpiA)、異檸檬酸脫氫酶基因 (icdA) 和蘋果酸脫氫酶基因 (mdh) 可以提高番茄紅素產(chǎn)量，fbaA、tpiA和mdh效果最明顯。gdhA和2,3-二磷酸甘油酸磷酸變位酶基因 (gpmAB) 雙敲除，同時(shí)高表達(dá)mdh和磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因(pps)，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到283 mg/L[6]。Farmer等通過高表達(dá)pps，平衡磷酸烯醇丙酮酸PEP和3-磷酸甘油醛 (G3P) 供應(yīng)提高番茄紅素產(chǎn)量[7]。Sun 等調(diào)控MEP途徑關(guān)鍵基因、中央代謝途徑和ATP合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)，進(jìn)一步提高番茄紅素產(chǎn)量[8]。Wu等通過增加產(chǎn)番茄紅素大腸桿菌株細(xì)胞膜的含量，增加菌體承載番茄紅素的能力進(jìn)一步提高番茄紅素產(chǎn)量[9]。

將MVA途徑基因引入大腸桿菌可以提高萜類化合物前體物質(zhì)供應(yīng)，提高番茄紅素產(chǎn)量[10-14]。含有來自鏈霉菌屬 (Streptomycessp.CL190) 的整個(gè)MVA途徑的重組大腸桿菌，番茄紅素產(chǎn)量是僅含有MEP途徑的重組大腸桿菌的2倍。但是，甲羥戊酸途徑酶的高水平表達(dá)可能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。Pitera等發(fā)現(xiàn)過表達(dá)乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因 (atoB)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因 (mvaS) 和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1 (hmg1)，可以使MVA途徑中間體羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMGCoA) 積累，從而抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。當(dāng)使用MVA途徑增加紫穗槐二烯產(chǎn)量時(shí)，由erg12編碼的甲羥戊酸激酶 (MK) 被鑒定為另一種限速酶[16]。因此，MVA途徑各基因平衡表達(dá)，減少M(fèi)VA途徑有毒中間產(chǎn)物積累，成為提高番茄紅素產(chǎn)量的重要手段。

Ye 等用Ⅱ型限制性內(nèi)切酶基礎(chǔ)上的模塊(Type Ⅱs restriction based combinatory modulation，TRCM) 構(gòu)建MVA途徑5個(gè)基因的RBS文庫(kù)，根據(jù)菌株顏色，篩選到分別使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高86%和96%的質(zhì)粒[17]。本研究從已經(jīng)精細(xì)調(diào)控MEP途徑基因的產(chǎn)番茄紅素菌株LYC101出發(fā)，研究MVA途徑協(xié)調(diào)表達(dá)對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，并整合MVA途徑基因使其穩(wěn)定表達(dá)，提高番茄紅素的產(chǎn)量和產(chǎn)率。

圖1 重組大腸桿菌中番茄紅素合成途徑(表示包含多步催化反應(yīng))Fig.1 Construction of lycopene synthetic pathway in E. coli through MVA and MEP pathway.represents multi-steps reaction.

1 材料與方法

1.1 試劑

氨芐青霉素、氯霉素和SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；Trans 2K Plus DNA Marker、EasyTaqPCR SuperMix DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物工程公司；PrimeSTARTMHS DNA聚合酶和DNase Ⅰ (Recombinant DNase Ⅰ，RNase-free，Cat，No 2270 A) 購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；Gold ViewⅠ型核酸染色劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PhusionTM超保真DNA聚合酶購(gòu)自NEB公司；番茄紅素標(biāo)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(Cat.No.75051)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)，Shimadzu UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu，Kyoto，Japan)；PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；電轉(zhuǎn)儀MicroPulser；臺(tái)式高速離心機(jī)，Eppendorf 5415D；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series 1200。實(shí)時(shí)定量PCR儀，CFX connectTMReal-Time system (Bio-Rad，Hercules，USA)。

1.3 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化鈉；氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素終濃度分別為100、34、50 μg/mL。LB固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

LB+2%甘油培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g氯化鈉和20 mL甘油。

1.4.2 番茄紅素產(chǎn)量測(cè)定方法

保存于-80 ℃的菌種在LB平板上劃線活化，挑取單菌落接種到15 mm×100 mm試管 (含4 mL LB培養(yǎng)基) 中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL三角瓶 (含10 mL LB+2%甘油培養(yǎng)基) 中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h。收集菌體用于測(cè)定番茄紅素含量。每個(gè)待測(cè)樣品分別有3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取自3個(gè)平行的平均值。

測(cè)定番茄紅素產(chǎn)量時(shí)，先取500 μL待測(cè)菌液，于13 000 r/min離心5 min，無菌水清洗后，用1 mL丙酮懸浮沉淀，在55 ℃黑暗條件下萃取15 min，然后將樣品在14 000 r/min下離心10 min，含有番茄紅素的上清過濾后用于測(cè)定番茄紅素產(chǎn)量。用高效液相色譜測(cè)定番茄紅素的濃度[12]。檢測(cè)條件：VWD 檢測(cè)器，Symmetry C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇：乙腈∶二氯甲烷 (21 ∶ 2 1 ∶ 8 )，流速1.0 mL/min，時(shí)間20 min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)480 nm。每個(gè)待測(cè)樣品分別有3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取自3個(gè)平行的平均值。用購(gòu)自Sigma公司的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。單位細(xì)胞干重 (DCW)用1OD600=0.343 g干細(xì)胞來?yè)Q算。

1.4.3 整合質(zhì)粒構(gòu)建

用Golden Gate方法構(gòu)建質(zhì)粒[17-18]，首先構(gòu)建pPoxB-N20質(zhì)粒，用于將外源基因通過cas9輔助方法插入到重組大腸桿菌的丙酮酸氧化酶基因 (poxB) 位點(diǎn)。以pACYC184-gRNA質(zhì)粒為模板，以N20-B-F1/N20-B-R1 擴(kuò)增質(zhì)粒骨架、以poxB-N20-B-F2/N20-B-R2為引物擴(kuò)增含poxB基因上的N20片段的骨架，用poxB-bsaI-F1/poxBbsaI-R1擴(kuò)增待整合區(qū)域，將3個(gè)片段用Golden Gate方法進(jìn)行連接，得到pPoxB-N20質(zhì)粒，構(gòu)建流程見圖2。其中poxB-N20-B-F2引物上含cas9識(shí)別的poxB基因的一段與GCC相鄰的20個(gè)堿基(CGCCGACACGTTAGTGCTACT)，通過PCR將這20個(gè)堿基連接到gRNA上，用于識(shí)別目標(biāo)DNA，并對(duì)其進(jìn)行切割。

然后構(gòu)建用于重組的pPoxB-ALV23質(zhì)粒。用poxB-bsaI-F2/poxB-bsaI-R2對(duì)pPoxB-N20質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，得到含同源重組的poxB同源臂和cas9識(shí)別位點(diǎn)的N20的片段。用MVA-bsaI-F/MVAbsaI-R擴(kuò)增pALV23質(zhì)粒，得到pALV23質(zhì)粒上MVA途徑幾個(gè)基因及其啟動(dòng)子序列，將兩片段用Golden Gate方法進(jìn)行連接，得到pPoxB-ALV23，用于在LYC101中進(jìn)行同源重組。構(gòu)建菌株及所用質(zhì)粒見表1。本研究所用引物序列見表2。

1.4.4 CRISPR-Cas9系統(tǒng)輔助基因整合

根據(jù)Zhao等文獻(xiàn)報(bào)道[19]，用CRISPR-Cas9系統(tǒng)輔助整合MVA途徑基因。在LYC101菌株中轉(zhuǎn)化pRed_Cas9和pPoxB-ALV23質(zhì)粒，然后用阿拉伯糖誘導(dǎo)cas9表達(dá)，對(duì)染色體poxB的N20區(qū)域進(jìn)行切割，pPoxB-ALV23提供poxB同源臂和MVA途徑基因及啟動(dòng)子進(jìn)行整合。整合后用mvaE-430-r/poxB-yz-up引物進(jìn)行驗(yàn)證，整合成功、測(cè)序正確菌株命名為L(zhǎng)YC102。驗(yàn)證引物見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒表達(dá)MVA途徑基因?qū)Ψ鸭t素產(chǎn)量的影響

為了消除MVA途徑中間產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，本研究室用TRCM方法，通過構(gòu)建RBS文庫(kù)，將來源于糞腸球菌Enterococcus faecalisCGMCC No.1.2135的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶/HMG-CoA還原酶基因 (mvaE) 和mvaS基因，以及來源于肺炎鏈球菌StreptococcuspneumoniaeCGMCC No.1.8722的甲羥戊酸激酶基因 (mvaK1)、磷酸甲羥戊酸激酶基因 (mvaK2)和甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶基因 (mvaD) 用不同RBS連接到同一質(zhì)粒上，得到使MVA途徑協(xié)調(diào)

表達(dá)、從而β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的一系列質(zhì)粒[17]，其中pALV23和pALV145使β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，為了研究MVA途徑基因在重組大腸桿菌中對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，本研究將這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到兩株產(chǎn)番茄紅素重組大腸桿菌LYC001和LYC101中進(jìn)行研究。LYC001是在整合來自成團(tuán)泛菌Pantoea agglomerans的crtEIB基因的基礎(chǔ)上，分別用M1-37和M1-46啟動(dòng)子對(duì)MEP途徑的idi和dxs進(jìn)行調(diào)控的菌株，而LYC101是在LYC001基礎(chǔ)上對(duì)中央代謝途徑基因和MEP途徑關(guān)鍵基因ispG和ispH進(jìn)一步調(diào)控所得，LYC101的番茄紅素產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LYC001菌株[9,20]。用這兩株菌為出發(fā)菌株，研究?jī)蓚€(gè)質(zhì)粒分別對(duì)兩株菌番茄紅素產(chǎn)量的應(yīng)用，考察質(zhì)粒在高、低產(chǎn)菌株作用是否相同。

圖2 質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.2 Construction of plasmid.

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this work

結(jié)果如圖3所示，LYC101中MEP途徑協(xié)調(diào)表達(dá)，消除中間體HMBPP積累引起的細(xì)胞毒性，細(xì)胞生長(zhǎng)略優(yōu)于LYC001，細(xì)胞OD600比LYC001高16.5%，而番茄紅素產(chǎn)量是LYC001的3.75倍。將pALV23和pALV145轉(zhuǎn)化LYC001和LYC101菌株后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有太大影響 (圖3A)。將pALV23和pALV145轉(zhuǎn)化LYC001后，番茄紅素產(chǎn)量分別提高了1.98倍和2.9倍，分別為14.87 mg/g DCW和19.45 mg/g DCW，兩個(gè)質(zhì)粒對(duì)番茄紅素產(chǎn)量提高與Ye文獻(xiàn)中對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高結(jié)果一致，pALV145質(zhì)粒提高類胡蘿卜素產(chǎn)量效果優(yōu)于pALV23質(zhì)粒。將pALV23和pALV145轉(zhuǎn)化LYC101后，番茄紅素產(chǎn)量分別提高了83%和37%，分別為34.12 mg/g DCW和25.66 mg/g DCW。pALV23質(zhì)粒提高番茄紅素產(chǎn)量效果優(yōu)于pALV145質(zhì)粒，因?yàn)長(zhǎng)YC101番茄紅素產(chǎn)量高于LYC001，推測(cè)在類胡蘿卜素產(chǎn)量不同的不同菌株中，使類胡蘿卜素產(chǎn)量更高的MVA途徑各基因表達(dá)比例并不相同，所以在低產(chǎn)類胡蘿卜素菌株中，pALV145質(zhì)粒優(yōu)于pALV23，而在高產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株中，結(jié)果相反，可能和代謝流和代謝中間體積累有關(guān)。

2.2 MVA途徑基因整合質(zhì)粒構(gòu)建

因?yàn)橘|(zhì)粒表達(dá)基因時(shí)，往往因?yàn)橘|(zhì)粒不穩(wěn)定而使質(zhì)粒大量丟失，從而影響工程菌目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[21]，為了使MVA途徑基因穩(wěn)定表達(dá)，本研究將MVA途徑基因整合到LYC101的poxB位點(diǎn)。

圖3 MVA質(zhì)粒在產(chǎn)番茄紅素菌株中驗(yàn)證Fig.3 Lycopene production and cell growth of strains with pALV23 and pALV145.(A) Cell growth.(B) Lycopene yield.

分別擴(kuò)增出構(gòu)建poxB-N20質(zhì)粒的3個(gè)條帶，結(jié)果如圖4A所示，分別得到2.2 kb的骨架1和400 bp的骨架2，以及2.9 kb的poxB基因片段。將3個(gè)片段用Golden Gate方法連接后，取陽(yáng)性克隆用P15A-YZ-Up/Pox-bsaI-R2引物進(jìn)行菌落PCR，驗(yàn)證構(gòu)建成功質(zhì)粒，結(jié)果如圖4B所示，PCR得到1.25 kb條帶，序列正確的質(zhì)粒為poxB-N20。

PCR方法擴(kuò)增pALV23質(zhì)粒上MVA途徑幾個(gè)基因及其啟動(dòng)子序列；用PCR方法擴(kuò)增含poxB-N20質(zhì)粒，得到含poxB同源臂和poxB基因中間一段gRNA識(shí)別序列的N20片段，將兩片段用Golden Gate方法進(jìn)行連接。將陽(yáng)性克隆用P15A-YZ-Up/ mvaE-430-r進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖4C所示，約1.85 kb條帶為正確克隆，得到pPoxB- ALV23，用于整合MVA途徑基因。

2.3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)輔助整合MVA途徑基因提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種強(qiáng)大的基因組編輯工具，利用靶點(diǎn)特異性的RNA (Guide RNA，gRNA)將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點(diǎn)，從而對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割。本研究根據(jù)Zhao等文獻(xiàn)報(bào)道，用CRISPR-Cas9系統(tǒng)輔助技術(shù)整合基因[19]。在LYC101菌株中轉(zhuǎn)化pRed_Cas9和pPoxBALV23質(zhì)粒，然后用阿拉伯糖誘導(dǎo)cas9表達(dá)，對(duì)染色體poxB的N20區(qū)域進(jìn)行切割，pPoxB-ALV23提供poxB同源臂和MVA途徑基因及啟動(dòng)子進(jìn)行整合。將誘導(dǎo)整合后菌液稀釋涂含阿拉伯糖和氯霉素、硫酸卡那霉素平板，用mvaE-430-r/poxByz-up引物對(duì)生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖4D所示，PCR驗(yàn)證得到1.5 kb的條帶，說明整合成功。將PCR驗(yàn)證正確菌株，用PCR擴(kuò)增完整MVA基因片段送樣測(cè)序，測(cè)序完全正確菌株為MVA途徑整合到LYC101的poxB位點(diǎn)的菌株。因?yàn)橘|(zhì)粒不穩(wěn)定，將本菌株在不加抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，在LB平板上劃線得到單菌落；挑取單菌落分別在LB平板和LB+氯霉素平板上劃線，在LB平板上生長(zhǎng)而在LB+氯霉素平板上不生長(zhǎng)的菌落為質(zhì)粒丟失成功菌株，命名為L(zhǎng)YC102。

圖4 構(gòu)建質(zhì)粒驗(yàn)證及重組驗(yàn)證Fig.4 Certify the correct plasmid and stain after MVA genes integrated.(A) PCR of backbone 1, backbone 2 and poxB gene for pPoxB-N20.(B) PCR verification of pPoxB-N20.(C) PCR verification of pPoxB- ALV23.(D) PCR verification of the recombination.

2.4 MVA途徑添加對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響

將整合成功菌株LYC102和出發(fā)菌株LYC101發(fā)酵，比較整合MVA途徑對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響。

結(jié)果如圖5所示，將質(zhì)粒pALV23的MVA途經(jīng)基因整合后菌株LYC102細(xì)胞生長(zhǎng)略有降低，OD600從15.02降低到12.6，降低了12%，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢可能和MVA途徑基因表達(dá)不夠協(xié)調(diào)有關(guān)，MVA途徑各基因表達(dá)不協(xié)調(diào)引起中間代謝物積累，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而部分限制細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。LYC102的番茄紅素產(chǎn)量明顯提高，從單位細(xì)胞產(chǎn)量18.68 mg/g增加到40.93 mg/g，增加了1.19倍，比用質(zhì)粒表達(dá)MVA途徑基因的菌提高了20%。LYC101菌株中MEP途徑和中央代謝途徑已經(jīng)進(jìn)行過精確調(diào)控，經(jīng)MEP途徑有效合成了萜類化合物合成的直接前體物質(zhì)IPP和DMAPP，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到18.68 mg/g DCW，添加MVA途徑后，增加了IPP和DMAPP的供應(yīng)，番茄紅素產(chǎn)率達(dá)40.9 mg/g。進(jìn)一步提高了番茄紅素的單位細(xì)胞產(chǎn)量。

圖5 MVA途徑基因整合后菌株番茄紅素產(chǎn)量及生長(zhǎng)Fig.5 Lycopene production and cell growth after integrating MVA genes.

3 討論

本研究利用從RBS文庫(kù)中篩選到的、使MVA途徑協(xié)調(diào)表達(dá)、利于β-胡蘿卜素合成的質(zhì)粒pALV23和pALV145研究其對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)番茄紅素的影響。結(jié)果表明，兩個(gè)質(zhì)粒在高、低產(chǎn)番茄紅素的菌株中都可以有效提高番茄紅素產(chǎn)量，但是，在高低產(chǎn)菌株中，兩個(gè)質(zhì)粒反應(yīng)不同。在低產(chǎn)菌株LYC001中，pALV145質(zhì)粒菌株番茄紅素產(chǎn)量高于pALV23質(zhì)粒菌株；而在高產(chǎn)菌株LYC101中，pALV23質(zhì)粒菌株番茄紅素產(chǎn)量高于pALV145質(zhì)粒菌株。pALV23和pALV145是從DXS37-idi46菌株中篩選而來，和LYC001基因型比較相似[8,22]，所以pALV23和pALV145在LYC001中的表現(xiàn)和在DXS37-idi46一致，即pALV145使LYC001和DXS37-idi46產(chǎn)類胡蘿卜素的量高于pALV23。而在番茄紅素產(chǎn)量較高的菌株LYC101中，pALV23和pALV145質(zhì)粒對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響與它們?cè)贒XS37-idi46影響相反，在DXS37-idi46中產(chǎn)量低的pALV23，反而在LYC101中得到較高的類胡蘿卜素產(chǎn)量。LYC101與DXS37-idi46相比，不僅MEP途徑和類胡蘿卜素合成途徑進(jìn)行過精確調(diào)控，中央代謝途徑的關(guān)鍵基因也進(jìn)行過調(diào)控，菌株環(huán)境發(fā)生了改變，所以兩個(gè)質(zhì)粒在菌株中反應(yīng)也會(huì)不同。另外，pALV23和pALV145中MVA途徑各基因RBS理論強(qiáng)度存在差別[17]，推測(cè)pALV23前兩個(gè)基因RBS強(qiáng)度較高，可能是pALV23質(zhì)粒在高產(chǎn)菌中利于類胡蘿卜素產(chǎn)量提高的關(guān)鍵因素。

本研究中MVA途徑基因整合后與MVA基因質(zhì)粒存在相比，番茄紅素產(chǎn)量提高20%，推測(cè)是質(zhì)粒在LYC101中不穩(wěn)定引起的。Ye等研究發(fā)現(xiàn)[21]，用質(zhì)粒表達(dá)外源基因時(shí)，發(fā)酵24 h，90%以上菌株質(zhì)粒丟失；因此，本研究中因?yàn)橘|(zhì)粒不穩(wěn)定性，MVA途徑基因在質(zhì)粒上以多拷貝形式存在時(shí)反而比染色體整合、單拷貝形式存在時(shí)番茄紅素產(chǎn)量更低。

另外，目前在大腸桿菌進(jìn)行無痕同源重組通常是用red重組酶輔助，sacB進(jìn)行反篩[22-23]。該方法需要進(jìn)行兩步同源重組，并且因?yàn)閟acB基因不是一個(gè)完全致死基因，如果插入片段較大，整合很困難，在反篩時(shí)很難得到整合成功菌株。本研究用CRISPR-Cas9技術(shù)輔助將MVA途徑基因和啟動(dòng)子一共6.7 kb條帶一次性整合到LYC101菌株的染色體上，因?yàn)?.7 kb整合片段和同源臂在質(zhì)粒上，在誘導(dǎo)過程中持續(xù)提供待整合片段，大大提高了整合效率[19]。

本研究通過同源重組將平衡表達(dá)的MVA途經(jīng)基因整合到LYC101中，得到遺傳穩(wěn)定的菌株LYC102，番茄紅素產(chǎn)率達(dá)40.9 mg/g，是出發(fā)菌株LYC101產(chǎn)量的2.19倍，比用質(zhì)粒表達(dá)MVA途徑基因的菌株提高了20%。在重組大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)合成萜類化合物前體物質(zhì)的MVA途徑和MEP途徑，可以有效提高番茄紅素產(chǎn)量；本研究構(gòu)建了不含質(zhì)粒的、遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)番茄紅素菌株，為產(chǎn)業(yè)化合成番茄紅素提供基礎(chǔ)；同時(shí)構(gòu)建平臺(tái)菌株，可以用于其他萜類化合物合成。