劉立朋，張秀利，張秀英*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 人體解剖與組織胚胎學(xué)系，北京100069；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 新民胸外科)

細(xì)胞凋亡(apoptosis)對(duì)維持機(jī)體正常生理功能起到重要作用[1]。有文獻(xiàn)揭示Bim可通過(guò)其下游蛋白導(dǎo)致線粒體膜上Bax/Bak發(fā)生寡聚化[2]，引起線粒體膜的通透性改變，釋放細(xì)胞色素C(cyt C)，激活凋亡蛋白 Caspases(如Caspase-3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。同時(shí)有文獻(xiàn)指出，miR-214 可以抑制骨肉瘤細(xì)胞及過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡[4,5]。本研究旨在探討miR-214調(diào)控的凋亡在肝纖維化小鼠中的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1C57BL/6 小鼠(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK2012

0001)于維通利華公司購(gòu)買，小鼠為雄性，體重18-22 g，6周齡，SPF級(jí)，于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房規(guī)范化飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 H&E試劑盒，天狼猩紅試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)； miR-214 agomir negative control，miR-214 agomir由北京歐林格生物科技有限公司合成；RNA 提取試劑Trizol；鼠抗α-SMA單克隆抗體(sigma)；兔抗Caspase-3單克隆抗體(CST)；羊抗兔 IgG-HRP，羊抗鼠 IgG-HRP(CST)；micro-RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Taqman)；PVDF 膜 (Merck Millipore)；ECL發(fā)光液(Bio-red)。

1.2 方法

1.2.1肝纖維化動(dòng)物模型制作 24只6周齡雄性 C57BL/6 小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，以每組12只隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組采用四氯化碳腹腔注射誘導(dǎo)肝纖維化，以1∶9的比例將四氯化碳溶于橄欖油中，按體重給予1 mL/kg，每周兩次，進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組僅用橄欖油進(jìn)行腹腔注射。四氯化碳注射6周時(shí)，采用尾靜脈注射方式，對(duì)照組注射 miR-214 agomir negative control ，實(shí)驗(yàn)組注射 miR-214 agomir每周注射一次，每次 1 nmol，共注射兩周。待造模8周時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行取材，部分肝組織放于 10% 福爾馬林溶液中用于石蠟包埋進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色；部分組織存放于-80℃超低溫冰箱用于 Western blot；少量組織存放于-20℃冰箱RNlater溶液中用于 Real-time 檢測(cè)。

1.2.2形態(tài)學(xué)染色 肝組織放于10%福爾馬林液中固定至少48小時(shí)后，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋。以4 μm厚度進(jìn)行石蠟組織切片，用于HE和天狼猩紅染色，光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)其病理程度并照相。

1.2.3Western blot檢測(cè)α-SMA 和 Caspase 3 的表達(dá) 造模6周時(shí)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各 40 mg,加入 650 μl RIPA 蛋白裂解液，冰上充分勻漿裂解，提取總蛋白液。對(duì)蛋白液進(jìn)行變性后，取約30 μg蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳，后以 300 mA 恒流轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。5% BSA 室溫封閉一小時(shí)，第一抗體α-SMA和Caspase 3(均為1∶3 000稀釋)于4℃過(guò)夜孵育，第二抗體(1∶4 000稀釋)室溫孵育1小時(shí)。使用FUSION FX7曝光儀器(法國(guó)VilberLourmat公司 )掃描并采集圖像。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)(Real-time PCR) 使用Trizol提取細(xì)胞或保存于RNlater溶液中的肝臟組織總 RNA，并根據(jù)供銷商提供方案對(duì)總 RNA 進(jìn)行 DNase I(北京全式金生物技術(shù)公司)處理。采用頸環(huán)引物將 RNA 逆轉(zhuǎn)為與 miR-214 對(duì)應(yīng)的 DNA，在 ABI 公司 7500 儀器中使用 SYBR Green Master mix 體系進(jìn)行檢測(cè)，將相應(yīng) CT 值(2-△△ CT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析。實(shí)時(shí)定量PCR及逆轉(zhuǎn)錄所用頸環(huán)引物microRNA 引物見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組纖維化明顯

造模6周時(shí)進(jìn)行取材，H&E及天狼星紅染色結(jié)果顯示(圖 1)：HE染色顯示對(duì)照組未見纖維增生，肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；而實(shí)驗(yàn)組肝臟組織纖維增生, 同時(shí)伴隨一定的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。天狼猩紅染色顯示實(shí)驗(yàn)組纖維增生明顯，可見明顯染色成紅色的纖維間隔。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝纖維化模型造模成功。

A,對(duì)照組H&E 染色； B,實(shí)驗(yàn)組H&E染色； C,對(duì)照組天狼猩紅染色；D,實(shí)驗(yàn)組天狼猩紅染色

2.2 肝纖維化小鼠肝組織內(nèi)miR-214 表達(dá)量顯著下降

四氯化碳注射4，6，8周后取材，實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 miR-214 在第4周時(shí)上升，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第6周和8周時(shí)表達(dá)量顯著下降，P<0.01(圖 2)。

2.3 miR-214 agomir干預(yù)組小鼠纖維化得到改善

Western blot 結(jié)果顯示miR-214 agomir干預(yù)組纖維化標(biāo)志蛋白α-SMA相較于 miR-214 agomir negative control 組表達(dá)量顯著下調(diào)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn) miR-214 agomir干預(yù)組凋亡蛋白Caspase-3 表達(dá)顯著下調(diào)(圖 3)。

3 討論

肝纖維化是一個(gè)極其復(fù)雜的病理過(guò)程，各種病因引起的慢性肝損傷均會(huì)導(dǎo)致肝臟進(jìn)行修復(fù)愈合，在此修復(fù)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和門靜脈區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)沉積。如果不能及時(shí)去除病因阻斷肝纖維化進(jìn)展，則可能進(jìn)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化甚至肝癌等終末期疾病。但是目前尚無(wú)臨床上證實(shí)的有效治療手段。因此對(duì)肝纖維化發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，阻斷其進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展，仍然具有重大的臨床意義。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)兩組小鼠肝組織中miR-214基因表達(dá)水平

圖3 免疫印跡檢測(cè)兩組小鼠肝組織中α-SMA以及Caspase 3蛋白的表達(dá)

大量研究揭示 MicroRNA 在慢性肝病及肝纖維化中發(fā)揮重要作用[6]。 miR-214 做為纖維化的調(diào)節(jié)分子引起了廣泛關(guān)注[7]，有研究指出在不同器官以及肝纖維化/肝硬化不同階段，肝組織 miR-214 表達(dá)是不同的。有文獻(xiàn)報(bào)道肝組織 miR-214 高表達(dá)促進(jìn)纖維化[8,9]，同時(shí)也有文獻(xiàn)指出在纖維化的早期階段肝組織 miR-214 表達(dá)下調(diào)[10]。本研究顯示在四氯化碳造模4周時(shí)，miR-214 表達(dá)上調(diào)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與本課題組前期基因芯片結(jié)果相符[11]。但在造模第6周及8周時(shí) miR-214表達(dá)顯著下調(diào)。我們的結(jié)果也印證了上述觀點(diǎn)，即在肝纖維化不同階段 miR-214 表達(dá)是不同的。這也提示我們，要對(duì) miR-214 在不同纖維化階段進(jìn)行更進(jìn)一步的檢測(cè)，明確其不同階段的作用。

有文獻(xiàn)指出 miR-214 與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，例如，miR-214 可通過(guò)對(duì)下游靶基因AIFM2 或 PTEN 基因調(diào)控抑制細(xì)胞凋亡[12,13]。更有文獻(xiàn)進(jìn)一步指出，在胰腺癌中Caspase 3 表達(dá)升高促進(jìn)凋亡[14]。我們發(fā)現(xiàn)miR-214 agomir干預(yù)組小鼠肝臟凋亡蛋白 Caspase 3 以及α-SMA 表達(dá)下調(diào)。我們推測(cè) miR-214 agomir干預(yù)后小鼠肝臟凋亡受到抑制，從而減輕了肝臟炎癥反應(yīng)，抑制了纖維化。然而 miR-214 在肝纖維化不同階段的調(diào)控作用，仍需深入研究，以便為臨床肝纖維化治療提供依據(jù)。