吳凱悅，朱珍，殷少軍，李耕誼，左晟，孔志斌，柳毅，李虹，宋爽，劉華

(上海市交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院東院呼吸內(nèi)科，上海 201306)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)病機制尚未完全明確，蛋白酶和抗蛋白酶失衡[1]可能是COPD發(fā)病的主要機制之一。組織蛋白酶S(cathepsin S)作為一種半胱氨酸蛋白酶，可作為COPD的生物標(biāo)志物[2]。本研究旨在研究COPD患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中cathepsin S的水平，分析其與COPD患者綜合評估分組及肺氣腫的關(guān)系，初步探討其在COPD病情評估中的作用，為進一步指導(dǎo)治療提供臨床依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

入選2014年4月至2017年4月在上海市第六人民醫(yī)院東院呼吸內(nèi)科門診隨診的COPD穩(wěn)定期患者46例，其中男性38例，年齡(65.7±11.8)歲，女性8例，年齡(66.4±10.7)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者需符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的“慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)”[1]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；除外其他疾病，吸入支氣管擴張劑后第一秒用力呼氣容積/用力肺活量(forced expiratory volume in one second/forced vital capacity, FEV1/FVC)<70%；近2個月內(nèi)咳嗽、咳痰和呼吸困難無明顯加重者為穩(wěn)定期。所有患者均處于臨床穩(wěn)定期并接受正規(guī)治療，納入試驗前2個月內(nèi)未使用抗生素，并且吸入藥物劑型劑量維持不變。

排除標(biāo)準(zhǔn)：口服和靜脈使用糖皮質(zhì)激素者；合并支氣管擴張癥、支氣管哮喘、肺間質(zhì)纖維化和肺部惡性腫瘤等除COPD以外的肺部疾病、糖尿病、肥胖、心功能不全、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管或腦部疾病、慢性腎臟疾病患者。

同時納入健康對照組29例，均為同期肺功能正常的就診者(包括伴有慢性咳嗽、聲音嘶啞的胸痛患者，來我科門診經(jīng)病史、喉鏡、心電圖、實驗室指標(biāo)、影像學(xué)、肺功能排除器質(zhì)性疾病，最后自愿要求行支氣管鏡檢查后排除器質(zhì)性疾病)，其中男性24例，年齡(65.6±11.0)歲；女性5例，年齡(66.3±9.6)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院臨床倫理委員會審核批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

記錄患者一般資料，用改良版英國醫(yī)學(xué)研究委員會呼吸問卷(modified British Medical Research Council，mMRC) 進行呼吸困難評分或采用COPD患者自我評估測試(COPD assessment test,CAT)問卷進行評估，記錄過去1年急性加重次數(shù)。按“慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)”中的COPD綜合評估分組標(biāo)準(zhǔn)，將入選患者分為4組：A組，CAT<10分、FEV1占預(yù)計值百分比≥50%且近1年急性加重次數(shù)<2次；B組，CAT≥10分、FEV1占預(yù)計值百分比≥50%且近1年急性加重次數(shù)<2次；C組，CAT<10分、FEV1占預(yù)計值百分比<50%或近1年急性加重次數(shù)≥2次；D組，CAT≥10分、FEV1占預(yù)計值百分比<50%或近1年急性加重次數(shù)≥2次。僅使用短效支氣管舒張劑治療就可達到緩解的輕度急性加重史不被納入急性加重史中。

測量所有研究對象的血壓、身高、體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)。所有研究對象在入選當(dāng)天整夜禁食，次日清晨靜臥位，采集外周靜脈血10 ml，使用酶法測定血糖、血脂和肌酐，高壓液相色譜法測定糖化血紅蛋白。估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)應(yīng)用慢性腎臟病流行病學(xué)合作研究(chronic kidney disease epidemiology collaboration，CKD-EPI)公式[3]計算。女性：SCr≤62 μmol/L，eGFR=144×(SCr/62)-0.329×(0.993)年齡；SCr>62 μmol/L，eGFR=144×(SCr/62)-1.209×(0.993)年齡。男性：SCr≤80 μmol/L，eGFR=141×(SCr/80)-0.411×(0.993)年齡；SCr>80 μmol/L，eGFR=141×(SCr/80)-1.209×(0.993)年齡。

所有研究對象按照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的肺泡灌洗常規(guī)檢查方法進行支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL)[4]。選擇右肺中葉，經(jīng)活檢孔注入2%利多卡因局部麻醉灌洗肺段，楔入纖維支氣管鏡，快速注入37℃滅菌生理鹽水，每次30 ml，總量90～120 ml，立即用100 mmHg負壓吸回灌洗液，回收率35%～45%。立即用無菌紗布過濾回收的灌洗液，裝入離心管離心(4℃，1 200轉(zhuǎn)/min，10 min)，收集上清液于-80℃冰箱儲存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(英國Abcam公司)測定BALF中cathepsin S濃度。試劑盒測定cathepsin S的檢測下限為4 pg/ml。采用瑞士席勒Spirovit SP-1肺功能儀檢查肺功能。

所有研究對象接受美國GE公司胸部高分辨率CT(high-resolution computed tomography，HRCT)檢查，分別在吸氣末憋氣和呼氣末憋氣連續(xù)掃描主動脈弓、氣管隆突上1 cm、隆突下1 cm、右肺靜脈下1 cm和右隔膜上2 cm。(1)肺氣腫程度評估：在GE軟件Thoracic VCAR中，設(shè)置CT值<950 Hu為低密度區(qū)，即為肺氣腫，自動辨識并定量低衰減區(qū)域(low attenuation area，LAA)，并計算其占全肺體積的百分比(LAA%)，即肺氣腫指數(shù)。根據(jù)Kitaguch方法進行LAA分級[5]。首先計算各層面的LAA評分：0分，LAA%<5%；1分，5%≤LAA%<25%；2分，25%≤LAA%<50%；3分，50%≤LAA%<75%；4分，LAA%>75%。將主動脈弓、氣管隆突下1 cm、右隔膜上2 cm這3個解剖層面6個視野評分相加評估肺氣腫總和： 0分，LAA 0級；1～6分，LAA 1級；7～12分，LAA 2級；13～18，LAA 3級; 19～24分, LAA 4級。每位患者的檢查由2名放射科主治醫(yī)師采用盲法獨立進行，并由1名放射科主任醫(yī)師審核，然后取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況及生化指標(biāo)

各組研究對象的性別、年齡、吸煙指數(shù)、BMI和血壓等一般狀況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表1)。各組間的生化指標(biāo)包括尿素氮、血肌酐、eGFR、空腹血糖、糖化血紅蛋白等差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表1)。近1年急性加重次數(shù)、CAT評分、FEV1/FVC(%)、FEV1占預(yù)計值百分比(%)、LAA%組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)。

2.2 各組BALF中cathepsin S水平

各組間BALF中cathepsin S水平存在顯著差異(F=2.419，P=0.016)，且與COPD綜合評估的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，cathepsin S的水平：D組>C組>B組>A組>健康對照組(P<0.01；表2)，提示cathepsin S水平隨著COPD病情程度的加重而升高。

2.3 不同肺氣腫程度患者cathepsin S的水平

單因素分析結(jié)果表明，LAA分級可顯著影響cathepsin S水平(F=5.141，P<0.001；表3)。cathepsin S水平在不同LAA分級中表現(xiàn)為：LAA 3級>LAA 2級>LAA 1級>LAA 0級(P<0.01；表3)，提示肺氣腫越明顯，cathepsin S水平越高。

表1 各組研究對象的一般情況比較

BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; BUN: blood urea nitrogen; SCr: serum creatinine; eGFR: estimated glomerular filtration rate; FBG: fasting blood glucose; HbA1c: glycosylated hemoglobin; COPD: chronic obstructive pulmonary disease; FEV1: forced expiratory volume in one second; FVC: forced vital capacity; FEV1/PRED: FEV1 of predicted; LAA: low attenuation area. Compared with control group,*P<0.05.

表2各組研究對象BALF中cathepsinS比較

Table 2 Comparison of cathepsin S level in BALF

GroupnCathepsin S levelA112.4±1.0?#△▲B73.3±1.2#△▲C134.1±1.6△▲D155.3±1.8▲Control290.5±0.3F2.419P value0.016

Compared with group B,*P<0.01; Compared with group C,#P<0.01; Compared with group D，△P<0.01; Compared with control group,▲P<0.01.

表3 不同肺氣腫程度患者BALF中cathepsin S水平比較

LAA: low attenuation areas. Compared with LAA 1,*P<0.01; compared with LAA 2，#P<0.01; compared with LAA 3，△P<0.01.

2.4 相關(guān)性分析

COPD患者的BALF中cathepsin S水平與前一年急性加重頻率、CAT評分、LAA%(r=0.497)呈正相關(guān)(P<0.05；表4)。

表4 BALF中cathepsin S與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

FEV1: forced expiratory volume in one second; FVC: forced vital capacity; LAA: low attenuation area; PRED: predicted; COPD: chronic obstructive pulmonary disease.

3 討 論

近年研究已發(fā)現(xiàn)一些新型的可潛在治療COPD的靶分子和信號通路[6-8]，蛋白酶是其中之一，可促進COPD肺氣腫發(fā)生和小氣道重塑[9-11]。cathepsin S是半胱氨酸蛋白酶家族的一員，是一種有效降解彈性蛋白的溶酶體酸性蛋白酶，人體cathepsin S最早由Shi等從肺泡巨噬細胞中提取，主要分布在淋巴結(jié)、脾臟、肺等器官，并在廣泛分布于肺部巨噬細胞和樹突狀細胞等參與COPD發(fā)病機制的主要細胞內(nèi)[12]。Rasmussen等[13]對COPD患者血清中cathepsin S的降解片段C3C進行測定，發(fā)現(xiàn)其水平顯著高于正常對照組。我們通過對COPD患者BALF中cathepsin S的檢測，發(fā)現(xiàn)其水平顯著高于正常對照組，提示cathepsin S的水平與COPD嚴(yán)重度存在關(guān)聯(lián)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，cathepsin S可能通過多種機制參與肺氣腫的發(fā)生。首先，cathepsin S參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)[14]，在抗原提呈中發(fā)揮重要作用。而近期的一個報道認為慢性阻塞性肺疾病是一種自身免疫性疾病，抗彈力蛋白、肺上皮細胞抗體、內(nèi)皮細胞抗體在疾病進展中起作用，尤其是嚴(yán)重疾病患者[15]。COPD患者BALF中cathepsin S水平和活性顯著升高，其升高原因可能與cathepsin S通過抗原提呈作用參與COPD患者自身免疫相關(guān)[16]。cathepsin S可驅(qū)動主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ,MHC Ⅱ)介導(dǎo)的T淋巴細胞活化，后者分泌干擾素-γ(interferon-γ,INF-γ)而激活巨噬細胞，趨化炎癥因子致肺損傷部位，提升肺內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，分泌大量蛋白水解酶，進而導(dǎo)致肺氣腫。過度表達白細胞介素-13(interleukin-13,IL-13)和IFN-γ的轉(zhuǎn)基因小鼠，其BALF中cathepsin S水平增高，更易獲得肺部炎癥，同時肺部結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致肺氣腫[17,18]。在另一個過度表達IFN-γ的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，cathepsin S通過促進上皮細胞凋亡，導(dǎo)致氣道擴張，加速肺氣腫的發(fā)展[19]。Geraghty等[16]發(fā)現(xiàn)IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細胞表達cathepsin S可能有助于COPD的發(fā)展。Reddy等[20]也證實肺泡巨噬細胞表達cathepsin S，后者破壞肺泡間隔，導(dǎo)致肺氣腫。Minematsu等[21]發(fā)現(xiàn)cathepsin S的5′側(cè)翼區(qū)功能性基因多態(tài)性與肺氣腫的發(fā)生相關(guān)。Nakajima等[2]對COPD患者血漿cathepsin S的研究發(fā)現(xiàn)，血漿cathepsin S與患者氣流受限程度和肺氣腫程度相關(guān)。我們的研究也提示BALF中cathepsin S與患者肺氣腫相關(guān)，通過單因素分析，發(fā)現(xiàn)不同的肺氣腫水平可影響B(tài)ALF中cathepsin S的水平；通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)LAA%與cathepsin S水平呈正相關(guān)，這與之前學(xué)者的研究結(jié)果一致。

cathepsin S同時也參與氣道炎癥的發(fā)生。慢阻肺急性發(fā)作大多由肺部感染所誘發(fā),細菌可導(dǎo)致炎癥細胞在氣道大量集聚，并釋放出大量cathepsin S，這可能是導(dǎo)致患者BALF中cathepsin S水平升高的一個重要原因。Weldon等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在無促炎刺激的情況下，BAL中cathepsin S分泌增加，可導(dǎo)致乳鐵蛋白、b-防御素家族等抗菌蛋白的降解，促進氣道炎癥。Deschamps等[23]的研究結(jié)果也顯示，預(yù)防性抑制cathepsin S可以改善氣道炎癥。我們的研究也發(fā)現(xiàn)cathepsin S與氣道炎癥引起的氣流受限和癥狀加重有關(guān)，通過對COPD進行綜合評估，發(fā)現(xiàn)其cathepsin S水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān),cathepsin S水平隨著COPD病情程度的加重而升高；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，COPD患者BALF中cathepsin S水平與前一年急性加重頻率、CAT評分正相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示BALF中cathepsin S與CT評估的肺氣腫嚴(yán)重程度相關(guān)，同時也可能反應(yīng)COPD的病情嚴(yán)重程度，提示可將cathepsin S作為COPD的表型標(biāo)志物，對COPD的個體化治療及療效監(jiān)測存在潛在的指導(dǎo)意義。Han等[24]研究證實定量高分辯率CT測定肺氣腫和氣道壁厚度的嚴(yán)重程度與COPD急性加重風(fēng)險存在一定聯(lián)系。Kim等[25]研究同樣發(fā)現(xiàn)，在肺部原有肺氣腫體積>35%的患者中，肺氣腫百分比每增加5%，COPD的急性加重發(fā)病率就會相應(yīng)增加1.2倍。由此可見，肺氣腫與COPD急性發(fā)作存在一定聯(lián)系，而我們的研究與之前研究一致。本研究的局限性：(1)本文研究BAFL中cathepsin S，無法確定其活化程度及其來源；(2)cathepsin S受血肌酐、血糖、血壓、年齡、激素用藥情況等多種因素影響，研究設(shè)計方案有待改進與細化；(3)本研究的研究對象來自于1所醫(yī)院，且樣本量較小，樣本代表性存在一定的局限性。