李仲平， 林詩雅， 鄭優(yōu)榮， 梁浩堅(jiān)， 王淏， 黃志健， 謝君謀， 陳錦艷， 李豐沛

廣州血液中心廣州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(血液安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室) (廣東廣州 510095)

為進(jìn)一步保障臨床用血安全，采供血機(jī)構(gòu)引進(jìn)核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(nucleicacid amplification test，NAT)對(duì)獻(xiàn)血者血液進(jìn)行HBV、HCV、HIV篩查，血液常規(guī)篩查血清學(xué)檢測的是抗原或抗體，NAT技術(shù)直接檢測病毒的核酸，彌補(bǔ)了病毒血清學(xué)檢測的不足，提高了檢測敏感度，大大縮短了相關(guān)病毒檢測“窗口期”，是血清學(xué)檢測的有力補(bǔ)充[1-2]。然而，在實(shí)際篩查中采供血機(jī)構(gòu)常檢測出一部分獻(xiàn)血者樣本血清學(xué)血液篩查合格而NAT檢測(3種病毒聯(lián)檢)呈陽性反應(yīng)，稱單項(xiàng)NAT陽性樣本，發(fā)現(xiàn)單項(xiàng)NAT陽性樣本后進(jìn)行NAT 鑒別試驗(yàn)，以鑒定出樣本含有何種病毒。按照現(xiàn)行的血液篩查策略，凡血清學(xué)篩查陰性而NAT聯(lián)檢為陽性的樣本即判為不合格，暫時(shí)屏蔽獻(xiàn)血者(3～6個(gè)月后可召回復(fù)查)。在實(shí)際檢測工作中存在相當(dāng)一部分單項(xiàng)NAT陽性而鑒別試驗(yàn)呈陰性的樣本，稱之為NAT非重復(fù)反應(yīng)性樣本，其檢測結(jié)果存在一定不確定性，獻(xiàn)血者血液的安全性及獻(xiàn)血資格更有待進(jìn)一步確定。目前有關(guān)規(guī)范尚未要求采供血機(jī)構(gòu)將NAT鑒別試驗(yàn)結(jié)果納入業(yè)務(wù)系統(tǒng)，工作人員也無法告知獻(xiàn)血者準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。為解答以上疑問，本研究對(duì)檢出的單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并追蹤回訪，結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年1月至2018年6月，廣州血液中心采集的無償獻(xiàn)血標(biāo)本1 166 333份。所有無償獻(xiàn)血者均符合現(xiàn)行的衛(wèi)生部《獻(xiàn)血者健康檢查要求》(GB18467-2001)，血液采集后同時(shí)留取1支核酸檢測標(biāo)本和1支酶免檢測樣本。NAT標(biāo)本采集、保存和處理等嚴(yán)格按照衛(wèi)生部NAT技術(shù)要求操作。采用無菌帶分離膠抗凝(K2-EDTA) NAT專用真空試管，留取5～6 mL全血標(biāo)本供NAT檢測。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 酶聯(lián)免疫法檢測設(shè)備 包括自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測分析儀 (瑞士HAMILTON，F(xiàn)AME24/30)，自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測加樣儀加樣儀(瑞士 HAMILTON，ML-STAR 8CH)，340rt酶標(biāo)儀(奧地利Anthos)，日立7180全自動(dòng)生化分析儀。主要篩查試劑：HBsAg采用北京萬泰和上?？迫A；抗-HCV采用珠海麗珠和上?？迫A；抗-HIV采用美國伯樂和北京萬泰；抗-TP采用北京萬泰和上?？迫A；ALT采用北京萬泰和上?？迫A，篩查試劑均經(jīng)國家批檢合格并在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 核酸檢測設(shè)備與試劑 蓋立福 Procleix TIGRIS和羅氏Roche s201系統(tǒng)，及配套核酸檢測試劑：諾華(Grifols) Proleix Ultrio及Ultrio Plus Assay核酸聯(lián)檢試劑盒及其核酸鑒別試劑盒，羅氏MPX 2.0試劑。

1.3 檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn) 獻(xiàn)血者血液樣本進(jìn)行ELISA(以下稱EIA)和核酸檢測。酶免檢測采用2種不同廠家試劑檢測獻(xiàn)血者血液標(biāo)本的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP 及ALT。任一檢測項(xiàng)目2種試劑反應(yīng)性判為不合格; 1種試劑反應(yīng)性者則用2種試劑對(duì)原管進(jìn)行雙試劑雙孔檢測，至少1孔反應(yīng)性者判為不合格。NAT有反應(yīng)性判為HBV、HCV、HIV NAT聯(lián)檢反應(yīng)性; 單項(xiàng)NAT陽性樣本進(jìn)行HBV、HCV、HIV NAT鑒別實(shí)驗(yàn)，分別使用3種病毒的特異性探針試劑以檢測樣本中是否存在相應(yīng)病毒，任一項(xiàng)目有反應(yīng)性判為鑒別反應(yīng)性，NAT鑒別試驗(yàn)結(jié)果僅作為科研數(shù)據(jù)保存，尚未納入常規(guī)獻(xiàn)血者業(yè)務(wù)系統(tǒng)。

1.4 獻(xiàn)血者追蹤回訪 單項(xiàng)NAT陽性的單采血小板獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血后3～6個(gè)月后進(jìn)行追蹤回訪，召回獻(xiàn)血者重新抽取血液樣本，復(fù)核全部血液篩查項(xiàng)目，檢測合格則解除獻(xiàn)血者的鎖定狀態(tài)，獻(xiàn)血者可以重新參加無償獻(xiàn)血；如檢測結(jié)果出現(xiàn)雙試劑陽性項(xiàng)目或重復(fù)原來單試劑陽性項(xiàng)，則屏蔽該獻(xiàn)血者。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，陽性率差異比較用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各年單項(xiàng)NAT陽性率情況 無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本1 166 333份，共檢測出單項(xiàng)NAT陽性樣本2 633例，陽性率為0.23%，863例鑒別陽性，鑒別陽性率為32.78%。各年單項(xiàng)NAT陽性率比較有差異，2=153.873,P<0.05；NAT鑒別陽性率有差異，2=21.894,P<0.05。見表1。

表1 單項(xiàng)NAT陽性樣本檢出情況

2.2 單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者復(fù)檢結(jié)果 我們對(duì)2 633單項(xiàng)陽性獻(xiàn)血者進(jìn)行電話回訪并召回，邀請(qǐng)獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血后3～6個(gè)月后回血液中心重新抽取血液樣本復(fù)查全部篩查項(xiàng)目。2015年1月至2018年6月共有665例單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者回到血液中心進(jìn)行復(fù)查，515例獻(xiàn)血者復(fù)查合格，解除獻(xiàn)血鎖定狀態(tài)，150例獻(xiàn)血者復(fù)查結(jié)果仍舊出現(xiàn)酶免檢測項(xiàng)目陽性或者仍為單項(xiàng)NAT陽性，本中心按照《獻(xiàn)血者歸隊(duì)指南》(第2版)中的要求，將其獻(xiàn)血資格永久屏蔽。見表2。

表2 單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者復(fù)查結(jié)果 例

注：各年解鎖率之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)意義(2=1.57,P>0.05)

2.3 解鎖獻(xiàn)血者后續(xù)獻(xiàn)血次數(shù)結(jié)果 515例解鎖的獻(xiàn)血者在復(fù)檢合格恢復(fù)無償獻(xiàn)血資格后，共有156例獻(xiàn)血者再次參加無償獻(xiàn)血1次，108例獻(xiàn)血者獻(xiàn)血2～3次，74例獻(xiàn)血者在解鎖后有多于3次的獻(xiàn)血記錄，以上獻(xiàn)血者(占65.63%)血液篩查結(jié)果均為合格，其余177例獻(xiàn)血者(占34.37%)至成稿沒有再次參加無償獻(xiàn)血。

2.4 單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者核酸鑒別試驗(yàn)結(jié)果 在召回復(fù)檢的665例單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者中，回顧性分析338例獻(xiàn)血者的鑒別試驗(yàn)結(jié)果，其中71例HBV DNA鑒別試驗(yàn)陽性(占21.01%)，沒有鑒定出HCV及HIV病毒核酸陽性樣本。見表3。

表3 338名單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者核酸鑒別試驗(yàn)結(jié)果 例(%)

2.5 NAT疑難結(jié)果獻(xiàn)血者后續(xù)獻(xiàn)血記錄追蹤 對(duì)35例在上一次獻(xiàn)血血液篩查中呈單項(xiàng)NAT陽性、HBV DNA NAT鑒別試驗(yàn)同為陽性，而在召回復(fù)查中全項(xiàng)合格的獻(xiàn)血者(首次NAT+，鑒別+，復(fù)檢-)進(jìn)行了后續(xù)獻(xiàn)血追蹤。12例獻(xiàn)血者至成稿沒有再次參加無償獻(xiàn)血，其余的23例獻(xiàn)血者隨后再次參加無償獻(xiàn)血，情況如下： 12例獻(xiàn)血者有1次或1次以上的獻(xiàn)血記錄，所有血液篩查結(jié)果均為合格； 7例獻(xiàn)血者在解鎖后的首次無償獻(xiàn)血血液篩查中再次出現(xiàn)單項(xiàng)NAT陽性的結(jié)果；其余4例獻(xiàn)血者解鎖后參加無償獻(xiàn)血，有1次或者1次以上的合格獻(xiàn)血記錄，但最后又再次出現(xiàn)單項(xiàng)NAT陽性。本中心暫時(shí)屏蔽對(duì)以上再次出現(xiàn)單項(xiàng)NAT陽性的獻(xiàn)血者，其血液產(chǎn)品作報(bào)廢處理。

3 討論

預(yù)防與控制輸血相關(guān)傳染病是輸血領(lǐng)域最關(guān)注的熱點(diǎn)之一。將NAT技術(shù)應(yīng)用于血液篩查，可以顯著降低因血清學(xué)漏檢而導(dǎo)致的輸血傳播疾病的殘余風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步提高血液安全[1,3]。國家衛(wèi)計(jì)委于2015年頒布實(shí)施《血站技術(shù)操作規(guī)程》，將NAT納入常規(guī)血液篩查中，在全國采供血機(jī)構(gòu)實(shí)行輸血相關(guān)病毒核酸檢測的全覆蓋[4]，我國許多城市自引入NAT后也多有相關(guān)報(bào)道[5]。

自2010年10月起廣州血液中心采用“2 遍ELISA+1遍NAT” 的篩查模式對(duì)獻(xiàn)血者血液進(jìn)行篩查，對(duì)廣州地區(qū)全部無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行HBV、HCV和HIV的NAT檢測。2015年1月至2018年6月共檢出2 633份酶免檢測陰性的單項(xiàng)NAT陽性樣本，陽性率為0.23%，高于趙紅娜等[6]報(bào)道鄭州地區(qū)的檢測結(jié)果0.06%，略低于王立林等[7]所報(bào)道的重慶市的陽性率0.28%。我們對(duì)665例單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者復(fù)查結(jié)果的追蹤分析，40例在復(fù)檢中血清學(xué)酶免檢測項(xiàng)目出現(xiàn)了陽性結(jié)果，其中21例HBsAg陽性，3例出現(xiàn)抗-HIV陽性(后確證為HIV感染)，可見這24例獻(xiàn)血者很可能由于處于酶免檢測“窗口期”以致的漏檢。血液常規(guī)篩查血清學(xué)檢測的是抗原或抗體，NAT檢測的是病毒核酸，NAT能從血清學(xué)檢測陰性的標(biāo)本中檢出漏檢的病毒感染者，是血清學(xué)檢測的有力補(bǔ)充。

2015年1月至2018年6月本中心單項(xiàng)32.78%的NAT陽性獻(xiàn)血者在鑒別試驗(yàn)中呈反應(yīng)性，與重慶市的結(jié)果32.77%[7]接近，而略高于青島市的結(jié)果(27.5%)[8]。目前核酸檢測系統(tǒng)鑒別試驗(yàn)的成功率偏低是目前國內(nèi)采供血機(jī)構(gòu)所面臨的共同問題[9]。這類樣本NAT結(jié)果的非重復(fù)性給采供血機(jī)構(gòu)造成了一定的困擾。筆者推斷血液NAT非重復(fù)性結(jié)果可能來自于以下兩方面。

第一、樣本首次NAT聯(lián)檢時(shí)出現(xiàn)假反應(yīng)性結(jié)果。在缺乏有關(guān)血清學(xué)補(bǔ)充試驗(yàn)(如：抗-HBc)和病毒定量分析結(jié)果的條件下，我們通過對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤回訪，重復(fù)全項(xiàng)血液篩查項(xiàng)目，對(duì)獻(xiàn)血者血液的安全性進(jìn)行評(píng)估。本研究發(fā)現(xiàn)，回顧性分析部分召回復(fù)檢的單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者鑒別試驗(yàn)結(jié)果，338例獻(xiàn)血者中有267例(占79.00%)的上一次獻(xiàn)血篩查中單項(xiàng)NAT陽性，但鑒別試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)。他們當(dāng)中有244例獻(xiàn)血者復(fù)檢合格，23例復(fù)檢NAT不合格。這244例獻(xiàn)血者共經(jīng)歷3次NAT檢測，具體為NAT聯(lián)檢(+)、NAT鑒別(-)、復(fù)檢NAT聯(lián)檢(-)。我們推斷他們?cè)诔醮蜰AT聯(lián)檢中出現(xiàn)了假反應(yīng)性結(jié)果。此外，有338例獻(xiàn)血者在解除獻(xiàn)血資格鎖定后繼續(xù)參加無償獻(xiàn)血1次或多次，檢測結(jié)果均為合格，推斷他們的單項(xiàng)NAT不合格為假陽性結(jié)果。本中心按照《獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)指南》(第2版)要求，根據(jù)復(fù)檢結(jié)果恢復(fù)了一部分本來屏蔽的獻(xiàn)血者的獻(xiàn)血資格。與此同時(shí)，我們也留意到177名獻(xiàn)血者在召回復(fù)檢合格后再無獻(xiàn)血的記錄，推斷假陽性篩查結(jié)果對(duì)獻(xiàn)血者的獻(xiàn)血熱情造成一定不良影響，NAT假陽性篩查結(jié)果所造成的血液資源浪費(fèi)和獻(xiàn)血者隊(duì)伍流失應(yīng)引起采供血機(jī)構(gòu)的注意。

第二、樣本中存在低濃度病毒核酸也可能造成鑒別試驗(yàn)假陰性結(jié)果。有國內(nèi)學(xué)者報(bào)道，NAT非重復(fù)反應(yīng)性樣本中也可能是由于樣本中的病毒濃度低，而造成鑒別試驗(yàn)的假陰性結(jié)果，這些樣本中的18.5%可以被定量系統(tǒng)檢測出HBV DNA，提示樣本中存在低濃度的HBV[8]。如病毒濃度處于極低的水平，由于病毒顆粒在血漿中的泊松分布，以至檢測取樣時(shí)未能吸取到帶有病毒的樣本[10]；也可能由于儲(chǔ)存和運(yùn)送條件不符合相關(guān)要求，或是干擾物質(zhì)的存在，導(dǎo)致樣本中病毒降解造成鑒別試驗(yàn)假陰性結(jié)果。本次研究數(shù)據(jù)顯示：59例單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者復(fù)檢仍為NAT陽性，當(dāng)中的23例雖然HBV DNA NAT鑒別試驗(yàn)為陰性，但在2次NAT 2次聯(lián)檢中均出現(xiàn)了陽性反應(yīng)，故不能排除是由于病毒濃度低所造成的鑒別試驗(yàn)漏檢，我們將在補(bǔ)充有關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)后另文報(bào)道。中國是乙型肝炎(乙肝)流行率較高的國家，HBV輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)主要來自于血清轉(zhuǎn)換前窗口期、變異病毒株和隱匿性HBV感染(OBI)三方面[11-12]。在開展核酸檢測以來，采供血機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室篩查出的單項(xiàng)NAT陽性樣本中，鑒別試驗(yàn)陽性的絕大多數(shù)都是HBV DNA陽性，提示OBI可能是導(dǎo)致NAT 聯(lián)檢陽性而鑒別檢測陰性結(jié)果的主要原因。OBI獻(xiàn)血者標(biāo)本中病毒濃度極低，易造成漏檢和重復(fù)檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象[13]。35例獻(xiàn)血者在血液篩查中NAT陽性，鑒別試驗(yàn)HBV DNA陽性，在獻(xiàn)血后3個(gè)月后他們的復(fù)查結(jié)果合格，按照《獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)指南》(第2版)建議，本中心解除了對(duì)他們的屏蔽狀態(tài)。我對(duì)23例有獻(xiàn)血記錄的獻(xiàn)血者跟蹤匯總，當(dāng)中12例獻(xiàn)血者在后續(xù)的獻(xiàn)血血液篩查中均合格，11例獻(xiàn)血者在解鎖屏蔽后再次獻(xiàn)血又再次出現(xiàn)單項(xiàng)NAT陽性的結(jié)果。已有報(bào)道，對(duì)于反復(fù)出現(xiàn)的NAT非重復(fù)反應(yīng)性樣本，采用其他NAT方法，或乙肝感染標(biāo)志物(如乙肝核心抗體)進(jìn)行檢測時(shí)，部分樣本仍然呈現(xiàn)陽性結(jié)果，提示這些樣本中存在一定比例的真陽性[8]?！东I(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)指南》(第2版)中建議采供血機(jī)構(gòu)永久屏蔽復(fù)查仍是單項(xiàng)NAT陽性(即連續(xù)2次NAT陽性)的獻(xiàn)血者，尚未覆蓋多次NAT結(jié)果不一致(間隔出現(xiàn)陰性與陽性)的非重復(fù)反應(yīng)性樣本，特別是NAT聯(lián)檢(+)、NAT鑒別(+)、復(fù)檢NAT聯(lián)檢(-)的樣本，單憑重復(fù)全項(xiàng)檢測有可能無法排除具有潛在傳染風(fēng)險(xiǎn)的血液，如：低濃度感染因子或病毒變異，而且如何區(qū)分假陽性樣本和病毒低濃度水平樣本，采供血機(jī)構(gòu)缺乏更有效可靠的檢測策略，獻(xiàn)血者血液安全性的判斷標(biāo)準(zhǔn)也有待改進(jìn)，在缺乏血清學(xué)補(bǔ)充試驗(yàn)結(jié)果和病毒定量結(jié)果以前解鎖NAT疑難結(jié)果獻(xiàn)血者，其獻(xiàn)出的血液可能對(duì)血液安全造成危害。

筆者認(rèn)為，采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)堅(jiān)持以血液安全為首要立足點(diǎn)，制定獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)策略，然而高敏感度NAT試劑的應(yīng)用無可避免會(huì)造成一部分血液資源由于篩查假陽性問題而浪費(fèi)，建議采供血機(jī)構(gòu)將NAT鑒別試驗(yàn)結(jié)果納入常規(guī)業(yè)務(wù)系統(tǒng)，對(duì)于單項(xiàng)NAT陽性樣本增加NAT檢測次數(shù)或使用敏感度相當(dāng)?shù)牧硗庖环NNAT檢測試劑進(jìn)行復(fù)查，相應(yīng)獻(xiàn)血者復(fù)查時(shí)補(bǔ)充HBV相應(yīng)血清學(xué)試驗(yàn)(如抗-HBc)及HBV DNA定量結(jié)果[14-16]，將有助于對(duì)獻(xiàn)血者血液的安全性作更準(zhǔn)確的評(píng)估，對(duì)單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者屏蔽或歸隊(duì)作更準(zhǔn)確判斷?？傊?，如何完善單項(xiàng)NAT陽性獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)檢測策略；愛護(hù)獻(xiàn)血者愛心，做好檢測結(jié)果告知與解釋將是采供血機(jī)構(gòu)今后的工作重點(diǎn)。