易凱， 趙嘉聞， 黎承楊， 程繼文， 趙雨桐， 馬晨俊， 廖乃凱， 鄧耀良

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科(廣西南寧 530021)

高鈣尿癥是草酸鈣腎結(jié)石形成和復(fù)發(fā)的重要危險因素[1]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的鈣離子可刺激腎小管上皮細胞損傷，細胞大量表達炎性因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。上皮細胞損傷后繼發(fā)出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是參與結(jié)石形成的重要過程，是當(dāng)前結(jié)石基礎(chǔ)研究的關(guān)注點之一[2]。我們前期的體內(nèi)及體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，含鈣腎結(jié)石患者尿液炎性細胞因子單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1) 和高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1) 生成增多，高鈣離子可刺激腎小管上皮細胞大量表達這兩種細胞因子[3]。因此我們設(shè)想，MCP-1和HMGB1在草酸鈣腎結(jié)石的形成過程中可能起重要作用，抑制這兩種細胞因子的生成可能對預(yù)防高鈣尿癥導(dǎo)致的草酸鈣腎結(jié)石的形成有效。細胞自噬是一種以溶酶體途徑的生物降解過程，對細胞生存、分化、發(fā)育和體內(nèi)平衡至關(guān)重要，并且細胞自噬參與人類許多疾病的發(fā)病機制，如癌癥、某些神經(jīng)退行性疾病、肌病和傳染病[4-5]。最近一些研究已經(jīng)證實細胞自噬與腎臟疾病有關(guān)[6]。目前，尚缺乏有關(guān)細胞自噬與炎癥和腎結(jié)石疾病是否存在關(guān)聯(lián)的文獻報道。2017年4—12月，我們進行體外細胞培養(yǎng)實驗，觀察高鈣離子誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞(HK-2)發(fā)生細胞自噬對細胞炎癥因子生成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 HK-2 (中國典型培養(yǎng)物保藏中心); 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR 相關(guān)試劑購自TaKaRa; 人MCP-1、HMGB1 和GAPDH 引物上海生工合成；Western blot所用二抗從購自Sigma；β-actin鼠一抗購自Abcam; LC3B兔一抗購自CST; beclin 1 兔一抗購自CST; MTT購自凱杰；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco；氯喹(CQ)、3-MA購自Sigma。

1.2 正常培養(yǎng)液和鈣離子培養(yǎng)液的配制 正常培養(yǎng)液為DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素混合液。鈣離子培養(yǎng)液使用6.66 g 二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)配制成含0.3 mol/L Ca2+的母液，經(jīng)過高壓滅菌冷卻后，用DMEM稀釋成含5 mmol/L、10 mmol/L Ca2+的兩個濃度梯度高鈣離子培養(yǎng)液。

1.3 實驗方法 體外培養(yǎng)HK-2細胞，分別用正常培養(yǎng)液(不含Ca2+溶液)，5 mmol/L Ca2+溶液，10 mmol/ L Ca2+溶液進行處理12 h，以及用10 mmol/L Ca2+液各處理0、6、12 h。之后采用Western blot檢測自噬標(biāo)記蛋白(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值)和自噬相關(guān)因子Beclin1的表達水平，實時定量PCR(RT-PCR)方法檢測細胞炎癥因子HMGB1及MCP-1的表達水平。同時，利用不同濃度的細胞自噬抑制劑3-甲基腺苷(0、5、10、15 mmol/L 3-MA)和氯喹(0、10、20、30 μmol/L CQ)分別預(yù)處理HK-2細胞6 h，隨后再用上述3個濃度梯度的Ca2+溶液處理HK-2細胞12 h，采用RT-PCR檢測細胞自噬對炎癥因子HMGB1及MCP-1表達的影響。另外，HK-2細胞分別用4個濃度梯度(0、10、20、30 μmol/L)CQ預(yù)處理6 h，再用10 mmol/L Ca2+培養(yǎng)液處理12 h，MTT法檢測各組細胞的細胞抑制率。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR) 處理的細胞直接在6 孔培養(yǎng)板中加入TRIzol 裂解細胞，按總RNA 提取試劑盒操作說明步驟提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA的濃度。取500 ng RNA用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄體系獲得cDNA。實時定量RT-PCR采用SYBR ExScript RT-PCR Kit試劑盒對胞內(nèi)的RNA進行定量，看家基因GAPDH表達作為內(nèi)參。反應(yīng)步驟：95℃ 30 s；95℃ 15 s；60℃ 1 min；40個循環(huán)。MCP-1 的上游引物為5′-AGCAGCAAGTGTCCCAAAGA-3′，下游引物為5′-GGTGGTCCATGGAATCCTGA-3′；HMGB1 的上游引物為5′-GATCCCAATGCACCCAAGAG-3′，下游引物為5′-TCGCAACATCACCAATGGAC-3′；GAPDH 的上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.5 蛋白印跡檢測(Western blot) 處理的HK-2細胞用無菌的PBS洗滌3次，RIPA細胞裂解液(含1%蛋白酶抑制劑(PMSF)(博士德)裂解細胞。裂解的細胞液蛋白濃度用BCA(bicinchoninic acid)法測定(碧云天)法測定。本實驗中Western blot使用的一抗?jié)舛确謩e為：兔抗-LC3B 1∶2 000；兔抗-beclin1:1∶2 000鼠抗-β-actin 1∶2 000，二抗?jié)舛?1∶5 000。Western blot步驟參照文獻[7]進行。

1.6 MTT 檢測各組細胞活力的抑制率 取生長良好的第5 代HK-2 細胞，以1×104/孔的密度接種于96 孔板，每個組設(shè)5個重復(fù)孔。處理的細胞每孔加入50 μL 的MTT 溶液，37 ℃孵育4 h 后，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO。用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長下，測定吸光度(absorbance，A) 值。根據(jù)公式: 細胞活力抑制率=1-(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值) 計算抑制率。

2 結(jié)果

2.1 高鈣離子誘導(dǎo)HK-2細胞自噬 不同濃度Ca2+液處理的HK-2細胞內(nèi)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白的表達相對水平的比值分別為1.00±0.34、2.10±0.10、3.89±0.21(P<0.05)；Beclin1的相對表達水平分別為1.00±0.06、2.12±0.17、3.28±0.29(P<0.05)，見圖1-A。10 mmol/L Ca2+液處理的不同時間段HK-2細胞內(nèi)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白的表達相對水平的比值分別1.00±0.12、3.06±0.24、4.24±0.28(P<0.05)；Beclin1的相對表達水平分別為1.00±0.15、2.58±0.30、3.55±0.37(P<0.05)，見圖1-B。

A:不同濃度高鈣離子溶液處理的HK-2細胞內(nèi)LC3B和Beclin1蛋白表達水平;B:10 mmol/L高鈣離子溶液處理不同時間的HK-2細胞內(nèi)LC3B和Beclin1蛋白表達水平

圖1高鈣溶液處理的HK-2細胞內(nèi)LC3B和Beclin 1蛋白表達水平

2.2 高鈣離子刺激HK-2細胞MCP-1、HMGB1的表達 與不含Ca2+溶液處理組比較，高鈣離子環(huán)境刺激下，HK-2細胞MCP-1和HMGB1 mRNA的表達顯著增多(P<0.05)，具有濃度及時間依賴趨勢。見表1。

項目不同濃度Ca2+液10 mmol/L Ca2+液處理不同時間0 mmol/L5 mmol/L10 mmol/L0 h6 h12 hMCP-11.00±0.313.27±0.46?4.65±0.23?1.00±0.102.67±0.05△4.29±0.27△HMGB11.00±0.051.34±0.20?1.56±0.16?1.00±0.071.30±0.19△1.67±0.24△

*與0 mmol/L Ca2+液組比較P<0.05; △與處理0 h組比較P<0.05

2.3 自噬抑制劑3-MA和CQ對高鈣離子環(huán)境刺激下HK-2細胞MCP-1和HMGB1表達的影響 不含CQ處理組與20 μmol/L CQ處理組細胞內(nèi)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表達水平的比值分別為：1.00±0.23、4.34±0.14，P<0.05；不含3-MA處理組與10 mmol/L 3-MA處理組細胞內(nèi)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值分別為：1.00±0.09、0.45±0.15(P<0.05)。見圖2。

與不含Ca2+溶液處理組比較，CQ或3-MA預(yù)處理能顯著下調(diào)高鈣離子誘導(dǎo)的細胞內(nèi)MCP-1 mRNA的表達水平(P<0.05)，CQ或3-MA預(yù)處理對高鈣離子誘導(dǎo)的細胞內(nèi)HMGB1 mRNA的表達無顯著影響(P>0.05)。見表2。

與不含CQ處理組比較，10、20、30 μmol/L CQ預(yù)處理能顯著下調(diào)高鈣離子處理的細胞內(nèi)MCP-1 mRNA的表達(P<0.05)，呈濃度依賴趨勢；CQ預(yù)處理對HMGB1 mRNA的表達無顯著影響(P>0.05)。見表3。

圖2 CQ和3-MA處理后LC3B-Ⅰ、Ⅱ蛋白的表達

Ca2+液CQ(20 μmol/L)3-MA(10 mmol/L)MCP-1HMGB1MCP-1HMGB10 mmol/L1.00±0.121.00±0.141.00±0.091.00±0.095 mmol/L 0.32±0.03?1.26±0.17 0.58±0.12? 0.96±0.1210 mmol/L 0.41±0.15?1.13±0.21 0.60±0.06? 1.16±0.10

*與0 mmol/L Ca2+液組比較P<0.05

因子0 μmol/L10 μmol/L20 μmol/L30 μmol/LMCP-11.00±0.110.77±0.15?0.46±0.09?0.30±0.11?HMGB11.00±0.091.09±0.141.13±0.171.04±0.21

*與0 μmol/L CQ處理組比較P<0.05

2.4 自噬抑制劑對高鈣離子環(huán)境下細胞活性的影響 與不含CQ處理組比較(未預(yù)處理組)，不同濃度的CQ預(yù)處理后，10 mmol/L Ca2+離子液處理的細胞抑制率顯著降低(P<0.05)，見表4。

CQ未預(yù)處理組預(yù)處理組10 μmol/L52.0±3.4043.0±6.30?20 μmol/L50.0±4.2033.0±7.30?30 μmol/L48.0±3.6024.0±4.12?

*與未預(yù)處理組比較P<0.05

3 討論

腎結(jié)石在形成過程中，腎小管上皮細胞會暴露在高濃度的鈣離子、草酸、草酸鈣和(或)磷酸鈣晶體中。高濃度鈣離子可刺激腎小管上皮細胞活性氧大量形成，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[2]。此外，活性氧還能激活細胞內(nèi)多個分子信號通路，包括轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB,炎性因子[如MCP-1、白細胞介素(IL)-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]生成增多[8]。上皮細胞損傷后繼發(fā)出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是參與結(jié)石形成的重要過程，其不僅可以導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥和纖維化，同時又可以進一步擴大炎癥反應(yīng)[2,9-10]。炎癥因子MCP-1、HMGB1均可趨化單核/巨噬細胞進入炎癥組織[11-12]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高鈣尿癥患者尿液炎性細胞因子MCP-1、HMGB1生成增多[3,13]。本研究結(jié)果進一步證實高濃度鈣離子能促進腎小管上皮細胞上調(diào)MCP-1、HMGB1的表達水平。

自噬是一種通過溶酶體途徑降解內(nèi)源性異常及過剩蛋白、損壞的細胞和細胞器的過程，它在維持細胞穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)包括細胞饑餓、細胞氧化應(yīng)激、活性氧、缺氧、蛋白質(zhì)聚集或受損細胞器等各種應(yīng)激狀態(tài)中起著重要的作用[14]。細胞自噬基本過程包括：在細胞質(zhì)中形成雙層膜結(jié)構(gòu)-自噬體，自噬體吞噬異常、過剩蛋白，損壞的細胞和細胞器；然后自噬體與溶酶體融合，自噬體運載的異常、過剩蛋白、損壞的細胞和細胞器在溶酶體中進行酶消化。使細胞有害物質(zhì)不僅從細胞中清除，而且被溶酶體消化后形成的新物質(zhì)還可用于合成新的蛋白質(zhì)或細胞[15]。自噬與腎臟疾病有明顯關(guān)聯(lián)，例如，自噬基因ATG 5或ATG 7突變能導(dǎo)致小鼠局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥[16]；TGF-β通過誘導(dǎo)自噬促進腎纖維化[17]。腎缺血再灌注性損傷的發(fā)生能誘導(dǎo)近端腎小管上皮細胞上調(diào)細胞自噬[18]。在本實驗中，體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞在高鈣離子刺激下，LC3B-Ⅱ(細胞自噬標(biāo)記蛋白)和Beclin1蛋白(細胞自噬形成中的重要因子)表達水平顯著上調(diào)，并且呈現(xiàn)時間及濃度依賴性，提示高鈣離子誘導(dǎo)了HK-2細胞自噬。

近年來有關(guān)細胞自噬與炎癥因子的相互作用被廣泛研究。在腎缺血再灌注性損傷研究中，自噬發(fā)生能抑制細胞HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10的表達[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1在心力衰竭疾病過程中不僅能趨化單核/巨噬細胞進入炎癥組織，還能通過誘導(dǎo)心肌細胞產(chǎn)生細胞自噬而促進心力衰竭[20]。在本實驗中，使用自噬抑制劑CQ或3-MA能有效地抑制高鈣離子刺激HK-2 細胞MCP-1的表達水平，但對HMGB1的表達無影響，提示高鈣離子刺激HK-2 細胞MCP-1的生成與自噬有關(guān)，而HMGB1的生成則與自噬無明顯關(guān)聯(lián)。結(jié)合以往研究結(jié)果，炎性因子MCP-1的生成可通過細胞氧化應(yīng)激[2]和自噬兩個途徑進行。

有關(guān)自噬對于器官的作用目前仍是有爭議的。在腎缺血再灌注性損傷中，有文獻報道自噬是腎臟保護因素，也有文獻報道自噬加重腎臟的損傷[18,21]。目前認(rèn)為在復(fù)雜的不同信號通路之間，細胞自噬不僅具有保護作用，同時也能促進細胞死亡[21-22]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)，暴露在草酸鈣晶體之下的腎小管上皮細胞自噬增多，提示自噬在草酸鈣晶體導(dǎo)致的腎小管上皮細胞損傷中起重要作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用CQ抑制細胞自噬后，高鈣離子誘導(dǎo)的細胞死亡率也明顯降低，細胞活性增加。本研究結(jié)果間接表明，高鈣離子誘導(dǎo)細胞自噬促進炎癥因子的表達及細胞死亡。抑制自噬可能對處于高鈣離子環(huán)境的腎小管上皮細胞起保護作用，減少炎癥反應(yīng)，進而減少草酸鈣腎結(jié)石的形成。

綜上所述，HK-2細胞在高鈣離子環(huán)境下炎癥因子MCP-1、 HMGB1表達增多，細胞自噬水平上調(diào)。抑制細胞自噬能夠減少細胞MCP-1的表達，改善細胞活力，但對HMGB1表達無明顯影響。仍需要進一步研究自噬與各炎癥因子相互作用并參與腎結(jié)石形成的具體機制。臨床上能否通過調(diào)控自噬來控制炎癥以達到預(yù)防和治療腎結(jié)石的目的，值得期待。