曹 雷 王增國 崔曉辰 胡士林

（①山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 山東 濰坊 261061 ②濰坊科瑞斯生物科技有限公司 山東 濰坊）

膠體金技術是80年代首先于免疫學領域發(fā)展起來的一門新技術。最初該方法僅用于免疫電鏡技術，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到被動凝集試驗、光鏡染色、免疫印跡、免疫斑點滲濾法、免疫層析技術、生物傳感器、PCR技術及染色體的基因定位的檢測等生物學各個領域。目前已廣泛應用于臨床診斷，對醫(yī)學臨床檢驗、食品加工等產生了巨大影響。該方法最大特點是簡單快速、準確直觀，特別適合于廣大基層單位、醫(yī)院、野外作業(yè)人員以及大批量時間緊的檢測和大面積普查等，因此該技術具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻们熬啊，F(xiàn)將膠體金技術在某些領域的主要應用做一綜述，希望能夠給從事相關研究的工作者提供一些幫助。

1 膠體金技術基本原理

（1）在還原劑作用下，氯金酸(HAuCl4)水溶液中的金離子被還原成金原子，并聚集成一定大小的納米金(nanogold)顆粒，在其表面吸附有負離子(AuCl2)和部分正離子(H+)形成吸附層，依靠靜電作用形成穩(wěn)定的膠體溶液，故稱為膠體金。膠體金標記技術的物理基礎是還原得到的金原子具有特殊的電子結構，在一些特殊的晶體面上存在著表面電子態(tài)，其費米能級恰好位于體能帶結構沿該晶面的禁帶之中，形成只能平行于表面方向運動的二維電子云[1]，使得膠體金顆粒具有高電子密度、介電特性、二次電子發(fā)射能力和催化作用等。金標過程實質上是蛋白質等大分子物質被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，其原理一般認為是在pH值等于或稍偏堿于蛋白質等點時，蛋白質呈電中性，此時蛋白質分子與膠體金顆粒之間靜電作用較小，而蛋白質分子的表面張力卻最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于膠體金顆粒表面形成蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，從而使膠體系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。（2）關于膠體金的制備已經(jīng)有很多文獻報道，其中最著名的是1857年Faraday等制備的金溶液歷時幾十年而穩(wěn)定。目前比較經(jīng)典的膠體金制備方法是檸檬酸鈉還原法、抗敗血酸還原法、白磷還原法等。還原劑的種類及濃度決定了金顆粒的粒徑大小。JAN W.SLOT等通過制備PA/Au探針對上述三種方法進行比較，論證了還原劑、膠體金顆粒大小及實驗效果之間的關系[2]。1971年，F(xiàn)aulk等將膠體金與蛋白質結合制成用于電子顯微鏡的金探針[3]，是膠體金應用于免疫細胞和組織化學的重要里程碑。此后膠體金逐漸應用于免疫化學，形成了四大免疫標記技術(熒光素、放射性同位素、酶和膠體金)之一的膠體金標記技術，并得到廣泛應用。

2 膠體金技術概況

人們對膠體金的研究已有四百多年的歷史，1857年Faraday等研究發(fā)現(xiàn)在膠體金溶液中加入少量電解質，溶液由紅色變?yōu)樗{色，最終凝聚為無色，而加入明膠等大分子物質后便可以阻止該變化。這一重大發(fā)現(xiàn)奠定了膠體金應用的科學基礎。1939年Kausche等用金顆粒吸附煙草花葉病毒并在電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)金離子呈高電子密度，之后Feldherr等于1962年首次提出膠體金可以作為電子顯微鏡的示蹤標志物。1971年Faulk WP等用膠體金標記兔抗沙門氏菌血清，直接用于免疫細胞化學技術檢測沙門氏菌的表面抗原，開創(chuàng)了膠體金標記技術。1974年Romano等通過金標二抗(馬抗人IgG)建立了間接免疫金染色法。此后，膠體金標記技術迅速發(fā)展，被廣泛應用于各種生物大分子在細胞表面和細胞內部的定位、定性、形態(tài)發(fā)生和抗原特性等研究。1978年Geoghega等又將膠體金探針用于光鏡水平測定細胞表面標志。但光鏡下觀察膠體金標記物，所需金顆粒要大于20nm，且標記物濃度要高這就限制了免疫金染色法(Immunogold Staining, IGS)在光鏡水平推廣應用。1981年Danscher等用銀顯影法增強金顆粒的可見度，并提高了靈敏度。后來，Holgate等根據(jù)Danscher的方法將免疫金染色法與銀顯影相結合，建立免疫金銀染色法(Immunogold Silver Staining, IGSS)。1989年Spielberg F 等建立了斑點金免疫滲濾技術用于檢測艾滋病病毒抗體[4]。近年來，隨著人們對膠體金性質的深入理解，膠體金技術的應用已經(jīng)由免疫學滲透到生物傳感器、PCR技術及基因治療等領域。

3 膠體金技術在免疫學檢測中的應用

3.1 在電鏡水平上的應用 膠體金作為免疫標記物最早用于電鏡檢測，主要是因為膠體金有很高的電子密度，在電鏡下能顯示清晰可辨的顆粒?？乖贵w復合物的電子密度與其背景電子密度差異較小，電鏡下很難分辨這種結合，用高電子密度的膠體金標記抗體能增強顯色結果，電鏡下能準確的確定抗原分布。近年來膠體金技術在電鏡水平上的應用已經(jīng)從對組織細胞抗原定位研究發(fā)展到基因水平，主要體現(xiàn)在染色體的基因定位、基因表達的檢測、特定核酸序列在細胞內的空間分布及核酸復制過程的定性和定量分析等[5，6]。如鏈霉親和素-膠體金探針就能夠在染色體上對DNA序列超微結構進行定位，可用于哺乳動物組織成長及相關疾病的實驗室診斷。

3.2 在光鏡水平上的應用 膠體金不僅可作為電鏡水平的標記物，也適用于光鏡水平，各種細胞涂片、切片均可應用。主要體現(xiàn)在：結合單克隆抗體技術檢測細胞懸液或培養(yǎng)的單層細胞膜表面抗原[7]，檢測培養(yǎng)的單層細胞胞內抗原及組織中或亞薄切片中抗原的檢測。膠體金用于光鏡水平研究，其優(yōu)點是：不需要昂貴的熒光顯微鏡；彌補了其它標記物不可避免的本底過高和內部酶活性干擾等缺點；用硝酸銀可進一步提高顯色效果。因此有取代傳統(tǒng)的熒光素、酶和放射性物質標記的趨勢。

3.3 膠體金同樣也可以用于肉眼水平的檢測，如凝集試驗和膠體金免疫結合試驗 （1）單分散的膠體金溶膠呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化。當與相應抗原或抗體發(fā)生專一性反應后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，同時顆粒發(fā)生沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，變化的速度和程度與被測物的量相關，可用肉眼觀察結果或測A580nm加以定量，后者靈敏度更佳。膠體金凝集試驗的靈敏度優(yōu)于膠乳凝集試驗玻片法。（2）膠體金免疫結合試驗基本上采用“抗體-抗原-抗體-膠體金”夾心法，其基本原理是以微孔濾膜為載體包被抗原或抗體，加入待測標本后，經(jīng)濾膜毛細管作用使標本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結合，再通過膠體金結合物達到檢測目的。根據(jù)檢測裝置不同可分為斑點免疫金滲濾試驗(dot immuno gold filtration assay, DIFA)和膠體金免疫層析試驗(gold immunochromatography assay, GICA)[9]。（3）90年代以來，艾滋病感染人數(shù)已呈急劇上升趨勢，對于艾滋病的檢測和防治成為一個緊迫的課題。傳統(tǒng)的檢測方法主要采用酶聯(lián)免疫反應(ELISA法)，但該法操作程序復雜、時間長、成本高，給實驗室快速診斷帶來不便。因此一種以膠體金為標記物用于檢測艾滋病病毒抗體的滲濾試驗由運而生，確立了DIFA基本技術。其基本原理是將待測液(如血清)滴在一種預吸附有HIV抗原的特殊濾紙上，待測液中的抗體與濾紙上的抗原特異性結合，然后滴入金標抗人免疫球蛋白探針(gold-antihuman-IgG)，抗人IgG結合抗體-抗原復合物，金顆粒被吸附在濾紙上而顯色紅色斑點，即為抗體陽性；反之，若無抗體，則金顆粒將全部通過濾紙不顯斑點，即為抗體陰性(附圖)。DIFA檢測操作步驟與ELISA法相同，差別在于加樣、反應、和洗滌均通過滲濾完成，檢測全過程僅需幾分鐘，而靈敏度可達到ELISA水平。其原因在于：ELISA樣品中待檢抗原(或抗體)需經(jīng)擴散才能與固相上的抗體(或抗原)反應，并且如果反應時間太短將降低靈敏度。而在膜滲濾法中，抗原充滿膜的微孔，待測液層滲濾時抗原抗體緊密接觸形成免疫濃縮，從而提高了免疫效率。此外，研究發(fā)現(xiàn)金顆粒越小活性越高，靈敏度越好，但小于3nm的膠體金顏色淺，不利于肉眼觀察。因此，必須選擇合適粒徑大小的膠體金，并結合一些信號放大系統(tǒng)[10，11]，盡可能提高靈敏度及延長保存時間。目前，夾心式抗體抗原法檢測HIV抗體也已有報道，并已應用于臨床診斷。免疫層析是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨特的免疫分析方法[12，13]。膠體金免疫層析技術(GICA)是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術，與DIFA不同點在于液體移動方向不是徑向穿流，而是基于層析作用的橫向流動。其原理是：以條行纖維層析材料為固相，樣品由于毛細作用在層析條上泳動，此過程中樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應，免疫復合物被富集或截留在檢測帶上，而游離標記物則越過檢測帶與結合標記物自動分離，通過可目測的膠體金標記物判斷實驗結果。研究表明微孔濾膜的選擇、處理及受體的固定決定著免疫層析的質量：（1）在可選擇的濾膜如硝酸纖維素膜、尼龍膜、羧化纖維素膜、聚脂膜、純纖維素膜及玻璃纖維膜中，以硝酸纖維素膜(NCM)運用較多。這主要得益于NCM的兩個特性：較高的蛋白質吸附容量和良好的親水性。（2）受體的選擇需要具備一下要求：能夠與膜材料穩(wěn)定結合；具有較高的生物活性，保證有足夠的配體捕獲容量；具有較高的純度，保證特異性；具有良好的流動性，可在層析帶上加入高效助溶劑、表面活性劑等。此外，受體包被量的選擇，篩選和純化抗體、制備標記物等也是不容忽視的重要環(huán)節(jié)。近年來該技術發(fā)展迅猛，正向高靈敏、多項檢測和實現(xiàn)定量半定量等方向深入[14]。由此可見，在生物檢測中膠體金取代三大傳統(tǒng)標記物用于肉眼水平的檢測，這除了膠體金本身具有的特點外還有以下原因：試劑和樣本用量少，樣本量可低至1～2μl；沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質；時間短，檢測速度快；實驗結果可以長期保存；不需γ-計數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標檢測儀等貴重儀器。在以后的研究工作中，特別是在現(xiàn)地試驗中將顯示其巨大的優(yōu)越性。

附圖 膠體金探針檢測HIV示意圖

3.4 應用于流式細胞儀技術 應用熒光素標記的抗體通過流式細胞儀計數(shù)分析細胞表面抗原，是免疫學研究中的重要技術之一。但不同熒光素的光譜相互重疊，不能區(qū)分不同的標記，發(fā)展受到限制。因此，必須尋找一種非熒光素標記物用于流式細胞儀計數(shù)，從而可同時進行幾種標記。Boehner等研究發(fā)現(xiàn)膠體金可以明顯改變紅色激光的散射角，他們將膠體金標記的羊抗鼠Ig抗體應用于流式細胞儀分析不同細胞的表面抗原。結果發(fā)現(xiàn)，小鼠脾細胞可同時被熒光素和金標抗體標記，兩者互不干擾，并且金標記的細胞在波長為632.8nm處，90度散射角可放大10倍以上。因此，膠體金可作為多參數(shù)細胞分析和分選的有效標記物，用于各類細胞表面標志與細胞內含物的分析。

3.5 應用于免疫印記技術 免疫印跡是一種比較新的免疫化學技術，是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質分離，得到的區(qū)帶轉移至硝酸纖維素膜上，然后用酶免疫法，免疫熒光或放射免疫分析(RIA)法進行定量分析。膠體金也可用于該法的定量：轉移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體(一抗)作用后，再與金標二抗反應，充分漂洗后根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可對樣品中的特異性抗原進行定量。不僅如此，膠體金還可以用于該法進行定位分析。楊中漢等人就利用此法對玉米精細胞膜特異糖蛋白進行了定位，并且結合銀顯影放大技術，可增強金顆粒的可見性，大大提高了測定靈敏度，檢測下限可低至0.1ng[8]。膠體金應用于免疫印記技術具有一下優(yōu)點：（1）信號本底比大；（2）無處理放射性同位素的麻煩；（3）結果可長期保存；（4）可采用銀放大技術，靈敏度至少可提高10倍。

3.6 膠體金技術在其他領域中的應用 近年來，研究人員根據(jù)膠體金的物化性質，進一步擴展了膠體金標記的生物檢測技術。（1）膠體金顆粒獨特的生物效應、介電特性使得該技術在生物傳感器中的研究增多。葡萄糖氧化酶(GOD)薄膜可以作為測定血糖的生物傳感器，膠體金技術的引入大大增強了酶膜的活性[15,16]。研究發(fā)現(xiàn)，金的氧化還原電位為+1.68，有極強的奪電子能力，對于那些氧化還原電位較小的生物大分子參加的生化反應具有很強的催化作用，能明顯提高生物大分子生物活性。同時，膠體金在表面等離子體基元共振(SPR)中的應用顯著的增強了SPR的靈敏度[17]。Lyon LA等采用膠體金或金標生物大分子修飾金膜，構造SPR檢測系統(tǒng)的敏感薄膜，從而檢測到具有較大偏移的反射波谷，達到對SPR的放大作用[18]。Andrew通過對不同粒徑膠體金修飾的SPR進一步研究發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒大小對SPR的響應有很大影響：膠體金顆粒越大相應的SPR曲線變化越明顯。（2）膠體金密度比較大，金標抗體/抗原與相應抗原/抗體結合后，復合物質量有較大變化，可以用來提高石英晶體微天平(QCM)技術在DNA檢測方面的靈敏度[19]。雖然當前這種靈敏度只能提高2-3倍左右，但金標抗體能形成分子量巨大的復合物，所以在這方面有很大的應用潛力。同時，膠體金顆粒具有良好的導熱特性，可以有效的提高PCR效率。Min Li等發(fā)現(xiàn)向PCR反應體系中加入一定量(0.7nM)粒徑為13nm的膠體金顆粒后，冷熱轉換率大大提高、反應時間縮短，且不影響產物量。研究發(fā)現(xiàn)，膠體金顆粒的加入可以使普通PCR檢測靈敏度提高5～10倍，而對于適時定量PCR至少提高104倍[20]。膠體金的引入對于降低成本、提高反應效率和靈敏度具有重要意義。（3）膠體金具有良好的生物相容性以及極高的比重，可以作為基因運載體應用于基因治療，提高了基因導入的瞬時性和表達效率。人們對膠體金顆粒的免疫原性進行試驗研究發(fā)現(xiàn)，膠體金在半抗原載體和免疫增強佐劑方面也具有重要作用[21]。用膠體金作為半抗原載體來免疫實驗動物，可增強機體非特異性免疫反應，提高巨噬細胞吞噬作用；而膠體金作為佐劑對DNA疫苗的電穿孔擴張具有免疫增強作用。另外，研究還發(fā)現(xiàn)膠體金在腫瘤放射療法方面也具有重要意義[22]。

4 膠體金技術的優(yōu)缺點

（1）膠體金標記技術與免疫熒光、酶技術、免疫鐵蛋白、放射性同位素等標記技術相比有其獨特的優(yōu)越性和更廣泛的用途。 膠體金標記即可用于常規(guī)光鏡，也可用于熒光顯微鏡，其中光鏡應用的IGSS法是迄今最敏感的免疫組化方法。同時由于金顆粒具有很強的激發(fā)電子能力，還可用于掃描電鏡和X射線衍射分析等。膠體金是高電子密度顆粒性標記物，電鏡下分辨率高，對超微結構遮蓋少，并易與其他顆粒性結構相區(qū)別，具有較精確的定位能力。利用不同直徑膠體金顆粒標記不同抗原，可實現(xiàn)電鏡下的雙重或多重免疫標記。（2）免疫膠體金制備不需經(jīng)過化學反應交聯(lián)，多種生物大分子均可與金顆粒吸附形成復合物，且生物大分子活性保持不變。免疫金應用于免疫層析快速診斷技術，大大提高了檢測速度，準確可靠，特異性強，靈敏度高，檢測下限可達到1ng/ml；無污染，不含放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質；成本低廉，操作簡單，無需附加設備等，非常適合醫(yī)院、養(yǎng)殖場、診所和家庭等。但也曾有報道稱膠體金免疫層析快速診斷試紙條存在假陽性和漏檢率高的問題。假陽性或若陽性其主要原因是由于檢測時間過短，一般時間為5～10min；也有可能是強陽性樣品造成的拖帶現(xiàn)象；同時外界條件如溫度、濕度對其也有一定的影響。

5 結語

膠體金標記對生物分子的活性影響較小，且能標記很大一部分生物分子，是非常理想的標記物。膠體金顆粒獨特的物理效應和化學效應使其在生物學、免疫學和醫(yī)學等領域得到廣泛應用。隨著科學研究的不斷深入發(fā)展，基于膠體金應用的新技術、新方法即將問世，為科學研究及臨床診斷開辟新的途徑。今后，膠體金技術在生物檢測及醫(yī)學研究等領域會有更好的發(fā)展前景。