楊修鎮(zhèn) 尹伶靈 陳 玲 張呈軍 牛華星 劉少寧

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估重點實驗室 山東 濟(jì)南 250022）

標(biāo)準(zhǔn)加入法是指取一定量被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液精確加入到待測樣品中，根據(jù)加入被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液前后儀器測定響應(yīng)值來計算待測樣品中被測物質(zhì)量的一種方法。依據(jù)：A前/A后=X前/(X前+X加入) 得出：X前＝X加入/[(A后/A前)－1]式中：A前為加入被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液前待測樣品的儀器響應(yīng)值；A后為加入被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液后待測樣品的儀器響應(yīng)值；X前為待測樣品中被測物質(zhì)的量(未知)；X加入為待測樣品中加入被測物質(zhì)的量(精確加入)。

在分析中為了消除樣品基質(zhì)干擾，提高測定準(zhǔn)確度，往往推薦標(biāo)準(zhǔn)加入法，這種方法在原子吸收分光光度法、離子選擇性電極法、分光光度法、極譜法、氣相色譜法中應(yīng)用尤多[1～3]。本實驗室2018年6月參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管局組織的豬肉中磺胺類藥物殘留量能力驗證考核時，按照GB/T 20759-2006進(jìn)行了檢測，檢出陽性藥物磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶。但由于組織方未提供空白樣品本底，本實驗室自行選取的本底與考核樣品出現(xiàn)基質(zhì)不匹配，致使定量結(jié)果異常。由于缺乏被測藥物同位素內(nèi)標(biāo)無法采用內(nèi)標(biāo)法消除基質(zhì)效應(yīng)影響，故采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定了豬肉中磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶殘留量。采用該方法后，本實驗室取得了滿意定量結(jié)果并順利通過能力驗證考核。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Waters Xevo TQ-S高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀；電子天平(感量0.01g、0.00001g)；均質(zhì)機(jī)；渦旋混合器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；離心機(jī)；有機(jī)濾膜(0.22μm)；磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(德國Dr公司，含量≥98%)；磺胺二甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(德國Dr公司，含量≥98%)；生鮮豬肉(購于超市)；乙酸銨為優(yōu)級純，乙腈、甲醇、異丙醇、正己烷為色譜純；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和磺胺二甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10mg，置同一10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液500μL，置100ml容量瓶中，用10%乙腈溶液稀釋至刻度，配制成濃度為5μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 加入被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液前樣品前處理 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]方法，稱取試樣5.0g(精確至0.01g)置50ml離心管中，加入20g無水硫酸鈉和20ml乙腈，均質(zhì)2min，以8000r/min離心3min，上清液倒入100ml雞心瓶中，殘渣加入20ml乙腈，重復(fù)上述操作一次。合并提取液，向雞心瓶中加入10ml異丙醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃水浴蒸干，準(zhǔn)確加入1ml 10%乙腈溶液和1ml正己烷溶解殘渣。轉(zhuǎn)移至5ml離心管中，渦旋1min，以8000r/min離心3min，吸取上層正己烷棄去，再加入1ml正己烷，重復(fù)上述步驟，直至下層變成透明液體。取下層溶液，過0.22μm濾膜，供上機(jī)測定。

1.3.2 加入被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液后樣品前處理 稱取試樣5.0g(精確至0.01g)置50ml離心管中，精確加入5μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100μl后，自“加入20g無水硫酸鈉和20ml乙腈”起按加入被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液前樣品前處理方法制備，即得。

1.4 測定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：C1850mm×2.1mm，粒徑1.7μm；流動相：A相為乙腈，B相為0.01mol/L乙酸銨溶液；流速：0.3ml/min；進(jìn)樣量：2μl；柱溫：35℃；洗脫條件如表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5～7]方法，電離模式：電噴霧正離子(ESI+)，毛細(xì)管電壓：3v，離子源溫度：150℃，脫溶劑溫度：350℃，脫溶劑氣流速：550L/h.，脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮，采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的定性和定量離子見表2。

表2 磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶特征離子參考質(zhì)譜條件

1.4.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，取3批空白豬肉，每批中添加磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶50、100、200μg/kg 3個不同濃度(添加量分別為1/2MRL、MRL、2倍MRL)，每個濃度進(jìn)行6份，其中1份按加入被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液前樣品前處理方法制備，5份按加入被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液后樣品前處理方法制備，經(jīng)高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，按標(biāo)準(zhǔn)加入法計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 準(zhǔn)確度和精密度

在空白豬肉中添加3個不同濃度的磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶后按標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率試驗，結(jié)果見表3。

表3 豬肉中磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶的添加回收率

2.2 能力驗證考核樣品結(jié)果

本實驗室首先按照GB/T 20759-2006對能力驗證考核樣品進(jìn)行了檢測，由于組織方未提供空白樣品本底，存在自行選取的本底與考核樣品出現(xiàn)基質(zhì)不匹配帶來定量不準(zhǔn)確的風(fēng)險。本實驗室又采取標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行了測定，結(jié)果表明兩種定量方法測定的數(shù)值存在較大差異。本實驗室以標(biāo)準(zhǔn)加入法的結(jié)果進(jìn)行了上報，順利通過了能力驗證，結(jié)果見表4。

3 討論與小結(jié)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法由于高分離效能、高選擇性和高靈敏度適用于復(fù)雜樣品中藥物及其代謝產(chǎn)物的測定，其中以電噴霧電離(ESI)方式應(yīng)用最為廣泛，其電離方式固有的基質(zhì)效應(yīng)問題也逐漸引起人們的關(guān)注?；|(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生源于待測組分與樣品中的基質(zhì)成份在霧滴表面離子化過程的競爭，其競爭結(jié)果會顯著降低或增強(qiáng)目標(biāo)離子的生成效率及離子強(qiáng)度，進(jìn)而影響測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度[8]。由于基質(zhì)中某些干擾組分的存在會使待測組分離子生成的速度與標(biāo)準(zhǔn)品相比有顯著不同，為平衡這種差異2010年以前發(fā)布的檢測標(biāo)準(zhǔn)大多采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法。但在實際檢測中，因所測樣品具有不同的來源(例如我國生豬品種多達(dá)60多種，飼養(yǎng)技術(shù)及飼養(yǎng)環(huán)境也是千差萬別[9,10]，同時受屠宰、運(yùn)輸、保存等影響)，使得樣品基質(zhì)與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的基質(zhì)仍有較大差異，使得含同樣濃度目標(biāo)化合物的不同來源樣品的測定結(jié)果大不相同。為解決這一問題同位素內(nèi)標(biāo)法被廣泛采用，由于被測化合物與其同位素內(nèi)標(biāo)具有幾乎完全一致的化學(xué)性質(zhì)和不同的質(zhì)荷比，不但可以平衡基質(zhì)效應(yīng)的影響還可以減少前處理的操作誤差和系統(tǒng)誤差。但是同位素內(nèi)標(biāo)往往比較昂貴或者難以獲得，在不具備同位素內(nèi)標(biāo)的情況下仍需獲得準(zhǔn)確定量結(jié)果時就需要采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。標(biāo)準(zhǔn)加入法由于是在樣品本身中進(jìn)行添加，其同樣可以平衡基質(zhì)效應(yīng)的影響，但依據(jù)其定量原理，操作往往較為復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)溶液加入前及加入后均需準(zhǔn)確測定，對操作者的要求較高。

本文主要是在GB/T 20759－2006的基礎(chǔ)上變換定量方法，因此著重對準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行了研究未對專屬性、線性范圍、檢出限等一致內(nèi)容進(jìn)行累述。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量之前需先對樣品進(jìn)行預(yù)試驗來評估樣品中被測物質(zhì)的量，加入量宜與樣品中的量接近，如差距甚遠(yuǎn)仍會使定量不準(zhǔn)確。