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(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

先天性腎病綜合征(congenital nephrotic syndrome，CNS)是一類(lèi)非常罕見(jiàn)的腎病綜合征，通常定義為在出生后3個(gè)月內(nèi)發(fā)生的腎病綜合征，臨床表現(xiàn)符合大量蛋白尿、低白蛋白血癥、嚴(yán)重水腫和高膽固醇血癥的腎病綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)。腎病綜合征在兒童中的患病率為12/100 000～16/100 000兒童，年發(fā)病率為2/100 000～7/100 000兒童，其中CNS的發(fā)病更為罕見(jiàn)，大約為0.5/100 000新生兒[1]。根據(jù)病因CNS可為分原發(fā)性(遺傳性) CNS和繼發(fā)性(非遺傳性)CNS。原發(fā)性CNS是腎小球?yàn)V過(guò)屏障組成蛋白的編碼基因或其他相關(guān)基因突變所致，繼發(fā)性CNS多因?qū)m內(nèi)感染或母親疾病等所致，其中遺傳性因素所致的CNS占主要地位。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視對(duì)遺傳性腎病基因?qū)用娴难芯?。本研究采用二代測(cè)序(next generation sequencing ,NGS)的方法對(duì)一個(gè)CNS家系患病胎兒進(jìn)行基因突變檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示在該患兒的NPHS1基因發(fā)生復(fù)合雜合突變c.712+5G>A和c.3325C>T，分別遺傳自其父母，且c.712+5G>A為新報(bào)道的突變位點(diǎn)。再結(jié)合PCR和Sanger測(cè)序在該家系中進(jìn)行驗(yàn)證，從遺傳學(xué)的角度明確了該家系中患兒CNS的發(fā)病原因，為其臨床診斷提供了有力的證據(jù)，為該家系的遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供了分子依據(jù)。

1資料與方法

1.1臨床資料

1.1.1第一胎患兒臨床資料

患兒，女，出生于2015年4月，3月齡時(shí)因CNS、肺部感染、多器官功能衰竭夭折。患兒母親孕期無(wú)感冒、發(fā)熱等感染史，無(wú)放射線(xiàn)及毒物接觸史，無(wú)寵物接觸史。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院孕期產(chǎn)檢唐氏綜合征篩查、胎兒系統(tǒng)B超及四維彩超均未見(jiàn)明顯異常。該患兒胎齡34+4周因“橫位、胎膜早破、絨毛膜羊膜炎”于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院剖宮產(chǎn)娩出。分娩情況：孕婦體溫38.3℃，脈搏118次/分。剖宮產(chǎn)術(shù)前血常規(guī)：白細(xì)胞(WBC)13.47×1012/L，中性粒細(xì)胞百分比(N%)93.70%；C-反應(yīng)蛋白(C-reactive potein，CRP)49.30mg/L。剖宮產(chǎn)術(shù)中見(jiàn)羊水黃綠色，量約300mL，胎盤(pán)明顯增大，質(zhì)地糟脆。以臀位娩出一女活嬰，Apgar評(píng)分7-9-10分。新生兒身長(zhǎng)46cm，體重2 220g。查體：新生兒生命體征平穩(wěn)，面貌外觀未見(jiàn)明顯異常，肩背部、雙下肢明顯凹陷性水腫，四肢肌張力減低，左手橋貫掌，雙側(cè)小腿過(guò)度屈曲緊貼大腿，雙下肢伸展受限。一胎患兒出生第1天、第8天、2月齡時(shí)尿常規(guī)及生化檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。腹部超聲：雙腎實(shí)質(zhì)光電稍增強(qiáng)，腹水形成。患兒因“早產(chǎn)兒、新生兒輕度窒息、CNS、低蛋白血癥”于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院NICU住院治療，給予暖箱保暖、氧帳吸氧、預(yù)防出血、抗感染、靜脈營(yíng)養(yǎng)、補(bǔ)充蛋白等對(duì)癥支持治療后，患兒全身水腫較前明顯減輕，肌張力有所提升，進(jìn)食尚可，好轉(zhuǎn)出院。之后反復(fù)因“低蛋白血癥、肺部感染”住院治療，于3月齡時(shí)夭折。

表1 一胎患兒尿常規(guī)及肝功能檢測(cè)結(jié)果

注:括號(hào)中為參考范圍。

1.1.2第二胎胎兒臨床資料

二胎胎兒，因孕期產(chǎn)檢發(fā)現(xiàn)胎兒CNS于2017年7月孕27周時(shí)在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院引產(chǎn)。該家系母親孕前檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、感染四項(xiàng)、優(yōu)生四項(xiàng)、白帶常規(guī)等均未見(jiàn)異常。孕期產(chǎn)檢：孕早期胎兒頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency,NT)值正常；唐氏篩查：神經(jīng)管缺陷高風(fēng)險(xiǎn)；孕21周胎兒系統(tǒng)B超提示：臀位、胎兒雙腎體積略增大，回聲略增強(qiáng)、下腹部部分腸管回聲增強(qiáng)、胎兒雙心室強(qiáng)光點(diǎn)。夫妻雙方染色體核型未見(jiàn)異常。因既往不良孕產(chǎn)史、唐氏篩查神經(jīng)管缺陷高風(fēng)險(xiǎn)、超聲軟指標(biāo)異常，經(jīng)孕婦及家屬知情同意后于孕22周行羊水穿刺，羊水穿刺結(jié)果：胎兒染色體核型：46，XX；染色體微陣列(CMA)檢測(cè)結(jié)果陰性；羊水甲胎蛋白(AFP)>121 000ng/mL(正常參考值：1 266～26 300ng/mL)；羊水血清膽堿酯酶200IU/L；羊水蛋白定性：4+；羊水微量蛋白8 780.00mg/L(正常參考值：<30.00mg/L)；紅細(xì)胞定性2+。與同孕周羊水AFP水平相比該胎兒AFP明顯升高，羊水中大量蛋白尿，故高度疑診為CNS。與該家系夫妻雙方反復(fù)溝通后，其要求終止妊娠。

家族史：該家系夫妻雙方平素均體健，否認(rèn)近親結(jié)婚，雙方家族中無(wú)類(lèi)似疾病患者，無(wú)遺傳性疾病史。該CNS家系圖見(jiàn)圖1。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取

該CNS家系夫妻雙方知情同意后，采用依地酸鈉(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管抽取該夫妻雙方靜脈血各5mL，按血液基因組NPDNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取外周血基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 先天性腎病綜合征家系圖

1.2.2二代測(cè)序

將該家系中的二胎患病胎兒的新鮮臍帶組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎后放入研缽，倒入液氮磨成粉末，按DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取胎兒DNA，送至北京康旭醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，利用目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)特異性基因捕獲探針對(duì)多個(gè)腎病相關(guān)基因目標(biāo)區(qū)域DNA片段進(jìn)行捕獲，并結(jié)合NGS進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)NGS的測(cè)序結(jié)果，用PCR結(jié)合Sanger測(cè)序?qū)Χヌ杭捌涓改高M(jìn)行突變檢測(cè)和驗(yàn)證。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增NPHS1基因的6號(hào)外顯子和26號(hào)外顯子序列。引物序列：NPHS1-6F：TTGGTCAGATGTGGGGCTCT，6R：ACTCG￣ATGACAGGGGGTCCT；NPHS1-26F：AGGCT￣CTGAGGGAGGTTTGG，26R：GATCAAGGCA￣CCCAGTCCAG。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：95℃10min，95℃30s，60℃30s，72℃45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，之后進(jìn)行雙向測(cè)序。

2結(jié)果

2.1 NGS結(jié)果

分析NGS的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，二胎胎兒NPHS1基因存在6號(hào)外顯子c.712+5G>A及26號(hào)外顯子c.3325C>T兩個(gè)位點(diǎn)的復(fù)合雜合突變。變異c.712+5G>A的致病性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為剪切位點(diǎn)突變；c.3325C>T(編碼區(qū)第3 325號(hào)核苷酸由C變?yōu)門(mén))，該變異導(dǎo)致編碼第1 109號(hào)氨基酸Arg的密碼子變?yōu)榻K止密碼子(p.Arg1109Ter)，從而使肽鏈合成提前終止，形成缺少了132個(gè)氨基酸的截短蛋白，為無(wú)義突變,見(jiàn)圖2。c.3325C>T的致病性已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，與CNS Finnish型相關(guān)。上述變異均不屬于多態(tài)性變化，在人群中發(fā)生的頻率極低(所參考數(shù)據(jù)庫(kù)：1000Genomes、dbSNP)。

注：A.NPHS1基因；B.NPHS1基因編碼的正常Nephrin蛋白；C.NPHS1基因c.3325C>T(p.Arg1109Ter)突變后形成的截短蛋白。

圖2 NPHS1基因及Nephrin蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

Fig.2 Structure diagram of NPHS1 and Nephrin

2.2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)二胎胎兒及其父母用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證上述位點(diǎn)的突變情況，證明胎兒位于第6號(hào)外顯子的c.712+5G>A(編碼區(qū)第712號(hào)核苷酸后內(nèi)含子中第5位核苷酸由G變?yōu)锳)變異來(lái)源于父親；患兒位于第26號(hào)外顯子c.3325C>T(編碼區(qū)第3 325號(hào)核苷酸由C變?yōu)門(mén))的核苷酸變異來(lái)源于母親，與二代測(cè)序結(jié)果一致。其父母分別為上述雜合突變的攜帶者，該遺傳方式符合常染色體隱性遺傳，見(jiàn)圖3。

注：A為胎兒NPHS1基因c.712+5G>A變異來(lái)自于父親；B為胎兒NPHS1基因c.3325C>T變異來(lái)自于母親。紅色箭頭指示突變位點(diǎn)。

圖3家系NPHS1基因Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

Fig.3 Sanger sequencing verification results of NPHS1

3討論

3.1 CNS的基本概述

CNS是指生后3個(gè)月內(nèi)即出現(xiàn)符合腎病綜合征(大量蛋白尿、低蛋白血癥、嚴(yán)重水腫和高脂血癥)的臨床表現(xiàn)。CNS的預(yù)后很差，大多數(shù)病例死于出生后的半年以?xún)?nèi)，有部分病例在孕期宮內(nèi)就已經(jīng)發(fā)病，甚至是胎死宮內(nèi)，原因在于CNS往往表現(xiàn)為激素耐藥故很快進(jìn)展為急性腎衰竭，且合并感染等，唯一有效的治療方式是腎移植[1]。以往多根據(jù)腎病綜合征發(fā)生的早晚及嚴(yán)重程度進(jìn)行分型，隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，近些年不斷有引起CNS的致病基因被定位、克隆，所以越來(lái)越多的學(xué)者傾向于根據(jù)致病基因進(jìn)行分型。有報(bào)道稱(chēng)將近60%的新生兒腎病綜合征患者是由于發(fā)生基因突變而致病的[2]。CNS可根據(jù)有無(wú)其他系統(tǒng)受累分為孤立性先天性腎病綜合征和系統(tǒng)性先天性腎病綜合征。NPHS1基因突變是孤立性CNS的常見(jiàn)致病原因，除此之外NPHS2、PLCE1、WT1、LAMB2、COQ2和LMX1B等基因突變也可致CNS。CNS芬蘭型(CNF)為最常見(jiàn)的孤立性CNS，因編碼Nephrin的NPHS1突變所致，為常染色體隱性遺傳，在芬蘭其發(fā)病率約為1/8 200，在芬蘭以外的地區(qū)發(fā)病率明顯低，我國(guó)僅有散發(fā)病例報(bào)道[3-5]。

3.2 CNS的常見(jiàn)臨床表型

CNF臨床表現(xiàn)為典型的腎病綜合征，但其病因、病理變化、預(yù)后等與年長(zhǎng)兒或成人不同，臨床表型變異相對(duì)較小。CNF患兒出生時(shí)往往為早產(chǎn)，臀位、羊水污染和出生窒息史多見(jiàn)，出生體重1 500～3 500g，胎盤(pán)為大胎盤(pán)，胎盤(pán)重量可超過(guò)胎兒體重的25%，多無(wú)腎外畸形?；純浩鸩≡纾瑢m內(nèi)即可有臨床表現(xiàn)，出生后3個(gè)月之內(nèi)出現(xiàn)蛋白尿、水腫。臨床多見(jiàn)腹脹、腹水、矮小、耳低、眼距寬、鼻小、顱縫寬、骨齡和智力發(fā)育遲緩等，部分患兒可表現(xiàn)為肌張力低下[6]。腎臟組織活檢可能出現(xiàn)腎小管特征性改變，即近曲小管囊性擴(kuò)張，又被稱(chēng)為“小囊性病(microcystic disease)”，但并非見(jiàn)于所有患者，不是特征性的病理改變。實(shí)驗(yàn)室檢查：尿常規(guī)見(jiàn)尿蛋白增加，4～13g/dL，血尿常見(jiàn)；血生化見(jiàn)血漿白蛋白<30g/L,血膽固醇：5.2～15.6mmol/L，血肌酐和尿素在病程早期正常，后期可增高。腹部B超部分可表現(xiàn)為腎臟增大、腎皮質(zhì)高回聲與髓質(zhì)界限分明。自1970年以來(lái)，羊水中AFP濃度的升高被廣泛用于CNF的產(chǎn)前診斷，胎兒血清中含有高濃度的AFP，由于CNS患兒在宮內(nèi)排出蛋白尿，羊水的AFP水平顯著增高，先天性神經(jīng)管發(fā)育不全，也可出現(xiàn)羊水AFP水平增高，但其膽堿酯酶水平常同時(shí)增高可與CNF相鑒別。但有報(bào)道稱(chēng)NPHS1基因突變攜帶者也可出現(xiàn)羊水AFP濃度不同程度的升高，故羊水AFP濃度的升高不能作為CNF的特異性診斷指標(biāo)，只能作為重要的參考指標(biāo)。以上輔助檢查均具有一定的輔助診斷價(jià)值，CNS的臨床診斷主要根據(jù)腎病綜合征的表現(xiàn)和發(fā)病年齡而定，分子診斷發(fā)現(xiàn)致病基因?yàn)樵\斷的金標(biāo)準(zhǔn)?；仡櫾摷蚁档膬纱稳焉锸钒l(fā)現(xiàn)，一胎患兒出生后即表現(xiàn)為典型的低蛋白血癥、水腫、高脂血癥、大量蛋白尿，且出生時(shí)為早產(chǎn)，伴有宮內(nèi)感染、大胎盤(pán)，診斷為CNS；二胎胎兒宮內(nèi)即表現(xiàn)為大量蛋白尿，羊水穿刺羊水中AFP濃度異常升高，CNS高度可疑。對(duì)二胎胎兒進(jìn)行二代測(cè)序，檢測(cè)到胎兒在NPHS1基因上攜帶父源性c.712+5G>A突變和母源性突變c.3325C>T，其中c.3325C>T為已報(bào)道的CNF的主要熱點(diǎn)突變，c.712+5G>A突變?yōu)榧羟形稽c(diǎn)突變，可能造成NPHS1基因轉(zhuǎn)錄水平剪接異常，從而導(dǎo)致編碼的Nephrin蛋白結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常,進(jìn)一步影響腎小球的濾過(guò)功能。

3.3 NPHS1基因的功能和相關(guān)致病性

NPHS1基因位于19q12～q13.1,擁有29個(gè)外顯子，能轉(zhuǎn)錄4.3kb的mRNA，完整的cDNA編碼含有1 421個(gè)氨基酸的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)分子Nephrin(腎病蛋白)，是腎小球?yàn)V過(guò)屏障中的重要組成蛋白和功能蛋白。Nephrin蛋白屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞黏附分子，主要表達(dá)在腎臟，在腎小球?yàn)V過(guò)功能中發(fā)揮重要作用，是一種位于腎小球足突細(xì)胞裂孔膜的1型跨膜蛋白。Nephrin蛋白由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)包括8個(gè)免疫球蛋白(Ig)基序和1個(gè)纖連蛋白-Ⅲ樣模塊，NPHS1基因的2～20號(hào)外顯子編碼8個(gè)Ig基序，第22～23外顯子編碼纖連蛋白-Ⅲ樣模塊，24號(hào)外顯子編碼跨膜區(qū)，25～29號(hào)外顯子編碼胞內(nèi)區(qū)。人NPHS1基因2號(hào)外顯子的2個(gè)堿基對(duì)(CT)缺失(c.121delCT；p.L41fsX91)將導(dǎo)致Finmajor型CNF,而26號(hào)外顯子的1個(gè)堿基對(duì)無(wú)義突變(c.3325C>T；p.R1109X)將導(dǎo)致Finminor型CNF。Finmajor型CNF約占芬蘭CNS病例的78%，F(xiàn)inminor型CNF約占芬蘭CNS病例的16%，然而這兩類(lèi)突變?cè)谄渌N族和國(guó)家中并不多見(jiàn)。目前已報(bào)道的NPHS1基因突變約255種(突變類(lèi)型多樣，其中以錯(cuò)義突變最常見(jiàn)，其他還可見(jiàn)到無(wú)義突變、插入/缺失突變、剪切位點(diǎn)突變)[7]。本研究家系中NPHS1基因存在兩種突變類(lèi)型，其中來(lái)自于母親的c.3325C>T變異為Finminor突變，為NPHS1基因26號(hào)外顯子的無(wú)義突變，編碼形成長(zhǎng)1 109個(gè)氨基酸殘基，缺少了Nephrin蛋白的胞內(nèi)區(qū)(見(jiàn)圖2)；來(lái)自父親的c.712+5G>A變異為剪切位點(diǎn)突變，在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)等均未見(jiàn)報(bào)道，其是否致病需體外分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，由于該家系兩個(gè)患兒均未行尸檢故無(wú)法進(jìn)一步驗(yàn)證。但結(jié)合該家系的病史及CNF的遺傳方式，高度懷疑c.712+5G>A變異為NPHS1的新發(fā)致病性突變。由此推測(cè)NPHS1基因的兩個(gè)復(fù)合雜合位點(diǎn)突變是導(dǎo)致該CNS家系致病的病因。

3.4 CNS的治療及預(yù)后

CNS的治療比較棘手，需盡早明確疾病類(lèi)型，區(qū)分出原發(fā)性CNS和繼發(fā)性CNS，根據(jù)分型制定相應(yīng)的治療方案，繼發(fā)性CNS針對(duì)病因行抗感染治療、免疫抑制治療等。遺傳性CNS中激素耐藥性CNS約占激素耐藥型腎病綜合征的10%～20%，其中家族性CNS糖皮質(zhì)激素的耐藥性更高，NPHS2基因突變導(dǎo)致的CNS又被稱(chēng)為激素耐藥型CNS，但有報(bào)道稱(chēng)NPHS1導(dǎo)致的CNS預(yù)后要比NPHS2型腎病綜合征更差，對(duì)激素和免疫抑制劑的抗性更強(qiáng)[8]。所以多數(shù)CNS對(duì)于糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療無(wú)效，腎移植是最佳選擇。部分學(xué)者提出去腎臟治療，可在生后6～10個(gè)月行雙側(cè)腎切除，透析維持3～4個(gè)月，保證患兒成長(zhǎng)，改善營(yíng)養(yǎng)狀況，于2歲以后或體重達(dá)到7kg時(shí)進(jìn)行腎移植[9]。而在病程早期主要是提供足夠營(yíng)養(yǎng)，糾正低蛋白血癥，防止感染及電解質(zhì)紊亂。

近年來(lái)NGS技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床疾病的基因突變檢測(cè)，研究者可以根據(jù)基因突變的特點(diǎn)與其他傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合使用，相互配合取長(zhǎng)補(bǔ)短，幫助臨床上更加經(jīng)濟(jì)、精準(zhǔn)、快速地診斷疾病。CNS的致病基因種類(lèi)繁多，每個(gè)基因的致病位動(dòng)輒上百，如果用Sanger測(cè)序逐一排查經(jīng)濟(jì)效率極其低下，所以本研究選擇NGS和Sanger測(cè)序相結(jié)合的方法進(jìn)行基因診斷，幫助快速準(zhǔn)確的找到致病基因及致病位點(diǎn)，大大提高了檢測(cè)效率[10]。本研究進(jìn)一步豐富了NPHS1基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，為CNS的診斷、治療提供了有力的分子依據(jù)，為該家系的遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供了重要證據(jù)。