于海燕 閔連秋 王東玉 包翠芳

1)錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000 2)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000

癲癇是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加家庭負(fù)擔(dān)。許多抗癲癇類藥物都會(huì)對(duì)患者的認(rèn)知功能產(chǎn)生不同程度的損傷，所以尋求一種既能有效抑制癲癇發(fā)作，又能保護(hù)神經(jīng)功能的抗癲癇藥物成為了當(dāng)下治療癲癇的重要課題[1-2]。奧拉西坦是一種用于腦損傷以及神經(jīng)功能缺失的藥物，相關(guān)研究表明[3-4]，奧拉西坦能夠有效抑制癲癇患者的癲癇發(fā)作癥狀，并且對(duì)損傷神經(jīng)組織進(jìn)行組織和重建。蛋白酶Caspase-3和同型半胱氨酸(Hcy)作為兩種常用的神經(jīng)功能檢測(cè)指標(biāo)，可能參與了癲癇疾病的發(fā)病過(guò)程，并起重要的調(diào)控作用[5-6]。本文使用奧拉西坦對(duì)癲癇大鼠模型進(jìn)行干預(yù)治療，旨在探究奧拉西坦對(duì)癲癇的作用效果以及對(duì)Caspase-3、Hcy兩種指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取40只SD大鼠，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雄性，年齡3～6(3.8±1.5)個(gè)月，體質(zhì)量200～250(220±7.9)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，光照12 h/d，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間為1周。2組大鼠在年齡、體質(zhì)量上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑：兔抗大鼠Caspase-3抗體(均由根生化科技有限公司提供)；小鼠抗大鼠Hcy、Cx43抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；戊四氮、奧拉美唑、氯化鋰(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PCR緩沖液、MgCl2溶液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；魯米諾發(fā)光底液、MgCl2溶液(武漢博士德生物工程有限公司)；Cx43 mRNA引物(Invitrogen公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Sigma公司)。

1．2方法

1．2．1 建模：將40只大鼠隨機(jī)分為4組，各10只。對(duì)其中3組大鼠腹腔注射127 mg/kg的氯化鋰，24 h后腹腔注射戊四氮(35 mg/kg)。給予另一組大鼠腹腔注射同體積的無(wú)菌生理鹽水。PNASANI等[7]在注射戊四氮30 min后，觀察大鼠出現(xiàn)的面肌抽動(dòng)、咀嚼點(diǎn)頭、前肢陣攣、站立、后肢陣攣以及跌倒等癥狀。根據(jù)Racine分級(jí)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)分為[8]：Ⅰ級(jí)面部出現(xiàn)陣攣；Ⅱ級(jí)析出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)出現(xiàn)單側(cè)前肢抽搐；Ⅳ級(jí)出現(xiàn)雙前肢抽搐；Ⅴ級(jí)出現(xiàn)四肢抽搐以及失去平衡、跳躍并跌倒等。癲癇持續(xù)狀態(tài)定義是Ⅳ級(jí)以上癇性發(fā)作并且能夠持續(xù)30 min。如大鼠在建模過(guò)程中持續(xù)出現(xiàn)Ⅳ～Ⅴ級(jí)表現(xiàn)，說(shuō)明建模成功，最終建模成功24只。

1．2．2 分組處理：將24只癲癇模型大鼠分為模型組、奧拉西坦低劑量組和奧拉西坦高劑量組各8只，另10只大鼠為正常組。低劑量組大鼠給予奧拉西坦射液的劑量為30 mL/(kg·d)，高劑量組大鼠給予奧拉西坦射液的劑量為50 mL/(kg·d)；正常組和模型組大鼠，給予腹腔注射等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥處理7 d。給藥處理過(guò)程中，注意觀察大鼠的體溫變化，各大鼠在給藥處理期間均可以自由飲食。

1．2．3 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試：GRABENSTATTER等[9]使用Morris水迷宮對(duì)4組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測(cè)試，建造直徑1.25 m，高0.5 m的圓形水池，水深為0.3 m，水溫保持在(26.5±0.8)℃。在池壁上設(shè)置四個(gè)不同的標(biāo)志點(diǎn)，在水池中央設(shè)置一直徑9 cm，高28 cm的深色平臺(tái)，平臺(tái)頂部位于水面下1.5 cm處。訓(xùn)練測(cè)試期間水迷宮外參照物不變。訓(xùn)練過(guò)程持續(xù)5 d，以四個(gè)標(biāo)志點(diǎn)作為入水點(diǎn)，將大鼠放入池中，記錄所有大鼠游至平臺(tái)所用時(shí)長(zhǎng)，若2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)，潛伏期記為120 s。所有大鼠上臺(tái)后均停留30 s，隨后將其從不同的標(biāo)志點(diǎn)放入水中再次檢測(cè)。連續(xù)測(cè)試4 d，第5天撤去水中平臺(tái)，將大鼠從池壁放入水中，記錄1 min內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)。

1．2．4 癲癇發(fā)作情況：對(duì)3組癲癇模型大鼠進(jìn)行觀察，記錄3組大鼠驚厥潛伏期、癲癇發(fā)作頻率以及每次發(fā)作持續(xù)時(shí)間，并進(jìn)行組間比較。

1．2．5 大鼠海馬區(qū)形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)：所有大鼠樣本在實(shí)驗(yàn)及各項(xiàng)目檢測(cè)完成后均斷頭取腦，冠狀切取視交叉4 mm腦組織，使用濃度為4%的多聚甲醛固定2 d，用石蠟包埋，然后常規(guī)腦組織切片，切片厚度約為5 μm，通過(guò)硫堇染色對(duì)大鼠的海馬區(qū)形態(tài)進(jìn)行觀察，并用高倍的光學(xué)顯微鏡對(duì)海馬CA1、CA3區(qū)每1 mm段內(nèi)的胞核飽滿、細(xì)胞膜完整、核仁清晰的錐體細(xì)胞情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

1．2．6 標(biāo)本采集及大鼠海馬組織Caspase-3、Hcy水平檢測(cè)：用手術(shù)刀割取所研究大鼠海馬區(qū)組織，大小為1 cm×1 cm，保存在-50 ℃的冰箱中。使用前1 d取出，在5 ℃的環(huán)境中冰浴3 min后，用離心機(jī)以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速分離，取上清液，保存至-50 ℃的冰箱中。采用高效液相色譜法，將待測(cè)的標(biāo)本注入在色譜柱中，在壓力下進(jìn)行固定相移動(dòng)，經(jīng)過(guò)固定相與待測(cè)標(biāo)本中不同物質(zhì)相互作用，物質(zhì)會(huì)依次的離開(kāi)色譜柱，應(yīng)用檢測(cè)器捕捉物質(zhì)信號(hào)，嚴(yán)格按照高效液相色譜儀說(shuō)明書(shū)上的操作步驟進(jìn)行，對(duì)比分析所測(cè)的Caspase-3、Hcy水平。

2 結(jié)果

2．1癲癇模型建立情況使用30只大鼠進(jìn)行建模，建模成功24只，癲癇發(fā)作期間表現(xiàn)為陣發(fā)性肢體震顫、呼吸深且快，出現(xiàn)濕狗狀抖動(dòng)，站立不穩(wěn)，并伴隨陣發(fā)性抽搐、口吐白沫，興奮性極高。

2．2大鼠行為學(xué)觀察

2．2．1 4組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較：如表1所示，模型組大鼠逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于正常組、奧拉西坦低劑量組及奧拉西坦高劑量組，且?jiàn)W拉西坦高劑量組大鼠逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)短于奧拉西坦低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于正常組、奧拉西坦低劑量組及奧拉西坦高劑量組，且?jiàn)W拉西坦高劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)多于奧拉西坦低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2．2．2 3組癲癇大鼠驚厥潛伏期及癇樣發(fā)作情況比較：如表2所示，模型組大鼠驚厥潛伏期明顯短于奧拉西坦低劑量組及奧拉西坦高劑量組，且?jiàn)W拉西坦高劑量組大鼠驚厥潛伏期明顯長(zhǎng)于奧拉西坦低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組模型大鼠癲癇持續(xù)時(shí)間及發(fā)作頻率均顯著高于奧拉西坦低劑量組及奧拉西坦高劑量組，且?jiàn)W拉西坦高劑量組大鼠癲癇持續(xù)時(shí)間及發(fā)作頻率均低于奧拉西坦低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2．3大鼠海馬結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察如圖1所示，正常組和奧拉西坦高劑量組大鼠對(duì)側(cè)海馬無(wú)明顯損傷，海馬CA1、CA3區(qū)及齒狀回細(xì)胞無(wú)缺失現(xiàn)象，形態(tài)完整，排列整齊，胞核飽滿，核仁清晰，細(xì)胞有凸起且齒狀回神經(jīng)元呈帶狀分布，無(wú)苔狀纖維發(fā)芽情況；模型組大鼠海馬區(qū)域均可見(jiàn)較明顯的組織損傷，海馬CA1、CA3區(qū)及齒狀回排列紊亂、細(xì)胞疏松、細(xì)胞形態(tài)由正常的多角形變?yōu)槿切位蛘卟灰?guī)則圖形，殘留錐體細(xì)胞周圍能夠見(jiàn)到較多的細(xì)胞碎片，且伴有膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，苔狀纖維發(fā)芽明顯；低劑量奧拉西坦組大鼠海馬區(qū)損傷明顯少于模型組，排列較為緊密有序，且齒狀回?zé)o明顯神經(jīng)元缺失狀況，有輕微苔狀纖維發(fā)芽情況。

表1 4組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較

注：與正常組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與奧拉西坦低劑量組相比，#P<0.05

正常組C1區(qū) 正常組C3區(qū) 正常組齒狀回

模型組C1區(qū) 模型組C3區(qū) 模型組齒狀回

低劑量組C1區(qū) 低劑量組C3區(qū) 低劑量組齒狀回

高劑量組C1區(qū) 高劑量組C3區(qū) 高劑量組齒狀回圖1 不同組別大鼠海馬結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察(×200)Figure 1 Morphological observation of hippocampal formation in different groups of rats(×200)

2．4奧拉西坦對(duì)癲癇模型大鼠Caspase-3、Hcy水平的影響如表3所示，3組癲癇模型大鼠Caspase-3、Hcy水平與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常組大鼠Caspase-3、Hcy水平顯著低于模型組和奧拉西坦組，模型組Caspase-3、Hcy水平顯著高于奧拉西坦2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；奧拉西坦高劑量組Caspase-3、Hcy水平低于奧拉西坦低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，由于機(jī)體大腦神經(jīng)元的異常突發(fā)性放電所導(dǎo)致的短暫性大腦功能障礙，同時(shí)也是人體發(fā)作性意識(shí)喪失的原因[10-11]?；加邪d癇的患者在一定程度上會(huì)伴認(rèn)知功能障礙，但造成這種認(rèn)知功能障礙的原因目前還無(wú)準(zhǔn)確性的研究結(jié)論[12-13]。

一直以來(lái)，人們對(duì)于癲癇發(fā)病機(jī)制的研究一直使用動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，戊四氮(PTZ)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮藥物，依據(jù)戊四氮的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)使動(dòng)物產(chǎn)生抽搐，而且這種抽搐的持續(xù)時(shí)間比較短，還可以自動(dòng)停止，但能迅速使癲癇狀態(tài)達(dá)到高峰[14-15]。用戊四氮作為一種致癇藥物，使機(jī)體在導(dǎo)致癲癇后不會(huì)對(duì)自身的局部腦部組織造成破壞，而且還不會(huì)造成神經(jīng)元的損傷和壞死，有利于對(duì)癲癇腦組織形態(tài)學(xué)的觀察，所以采用戊四氮致癇的動(dòng)物模型是非常理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚16-17]。

本研究對(duì)癲癇大鼠采用奧拉西坦進(jìn)行治療取得較好抗癲癇效果。奧拉西坦是一種合成的羥基氨基丁酸環(huán)狀衍生物，臨床中主要適用于腦損傷以及腦損傷引起的記憶功能障礙和神經(jīng)功能缺失等[18-19]。奧拉西坦能夠穿過(guò)血腦屏障，能夠分布在機(jī)體的海馬區(qū)、紋狀體、中隔區(qū)以及皮層區(qū)中，主要作用于門冬氨酸受體，可以通過(guò)膽堿能系統(tǒng)對(duì)蛋白激酶C產(chǎn)生激動(dòng)作用，發(fā)揮改善腦組織能量代謝的作用，對(duì)神經(jīng)功能缺損機(jī)體的定向力、大腦認(rèn)知、記憶力以及抽象概括力作出有效改善[20-21]。奧拉西坦可以聚集未受損的腦組織進(jìn)行重新組織和重建，從而恢復(fù)機(jī)體神經(jīng)功能[22]。本研究通過(guò)Morris水迷宮對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，在奧拉西坦作用下，癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有顯著增強(qiáng)，且隨著奧拉西坦劑量的增加，增強(qiáng)效果更明顯。本研究還對(duì)癲癇大鼠驚厥潛伏期、持續(xù)時(shí)間以及發(fā)作頻率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在奧拉西坦的作用下，癲癇大鼠驚厥潛伏期明顯較短，發(fā)生頻率以及持續(xù)時(shí)間更少，而且隨著奧拉西坦劑量的增加，癲癇大鼠的發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，發(fā)生頻率以及持續(xù)時(shí)間明顯減少，說(shuō)明奧拉西坦對(duì)大鼠癲癇癥狀具有一定的抑制作用。

同型半胱氨酸(Hcy)屬于一種興奮性氨基酸[23]，同型半胱氨酸由于過(guò)度的聚集會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞興奮性增加，對(duì)機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞造成損害，且同型半胱氨酸在癲癇疾病的發(fā)病中發(fā)揮非常重要的作用。同型半胱氨酸作為一種興奮性物質(zhì)[24]，能夠刺激N-甲基-D-天門冬氨酸受體，使神經(jīng)元發(fā)揮毒性作用，造成機(jī)體神經(jīng)功能的損害[25-26]。同型半胱氨酸不僅可以引起多系統(tǒng)的代謝毒作用，還以對(duì)癲癇癥狀起到加重的作用[27-28]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，同型半胱氨酸能夠活化致癲灶[29]，致使局灶性的癲癇發(fā)作，且同型半胱氨酸的高水平表達(dá)能夠改變皮層腦電圖，導(dǎo)致機(jī)體全身抽搐[30-31]。本研究中，癲癇大鼠模型在經(jīng)過(guò)治療后的同型半胱氨酸水平明顯降低，而高劑量的用藥治療方式能夠更加顯著地對(duì)其水平產(chǎn)生抑制作用，說(shuō)明在經(jīng)過(guò)奧拉西坦治療后，癲癇大鼠本身的同型半胱氨酸水平從高水平降低，減少了神經(jīng)功能的損傷，改善了癲癇癥狀的產(chǎn)生，且用藥的使用劑量可以稍微增加以提高治療效果，與其他學(xué)者[32-33]的研究結(jié)果一致。Caspase-3是Caspase家族一種核心蛋白酶[34]，能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也稱死亡蛋白酶，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用[35]。激活Caspase-3能夠使細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及細(xì)胞骨架中的重要蛋白質(zhì)降解失活，使蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)被放大，從而引起細(xì)胞的凋亡[36]。相關(guān)研究表明，采用抗癲癇藥物對(duì)癲癇對(duì)象進(jìn)行干預(yù)后，Caspase-3的表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明Caspase-3在癲癇過(guò)程中起重要作用[37]。本研究中，經(jīng)奧拉西坦治療后的大鼠Caspase-3水平降低，說(shuō)明奧拉西坦對(duì)Caspase-3的功能產(chǎn)生較為明顯抑制作用，減少了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，與丁緒平等[19]研究結(jié)論一致。

表2 3組癲癇模型大鼠驚厥潛伏期及癇樣發(fā)作情況比較

注：與模型組相比，*P<0.05；與奧拉西坦低劑量組相比，#P<0.05

表3 4組大鼠Caspase-3、Hcy水平比較

注：與正常組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與奧拉西坦低劑量組相比，#P<0.05

奧拉西坦能夠?qū)Πd癇起到很好的抑制作用，延長(zhǎng)癲癇的發(fā)作時(shí)間，減少發(fā)病次數(shù)，且能夠降低Hcy和Caspase-3的表達(dá)水平，保護(hù)機(jī)體神經(jīng)功能不受損傷。