薛永常, 張成鎖, 李 根

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

微生物在次級(jí)代謝過(guò)程中產(chǎn)生豐富的活性天然產(chǎn)物。除以核糖體途徑，還能以非核糖體途徑合成一系列低分子量的具藥用價(jià)值的多肽類活性次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，可被用于抗生素、免疫抑制劑、抗癌和抗病毒因子、鐵載體及生物表面活性劑等[2]，已成為近幾年研究的熱點(diǎn)[3]。在微生物中非核糖體肽類次生代謝產(chǎn)物的生物合成是由非核糖體肽合成酶(NRPS)催化的。NRPS屬于模塊化酶，各相互獨(dú)立的模塊按特定空間、順序排列，在合成新生肽鏈的過(guò)程中具有不同的功能[4]。NRPSs至少含有腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(A)、肽?；d體蛋白結(jié)構(gòu)域(PCP)和縮合結(jié)構(gòu)域(C) 等3個(gè)核心結(jié)構(gòu)域。而A結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)合適的底物選擇并活化[5]， A結(jié)構(gòu)域10個(gè)氨基酸殘基呈口袋形狀，為底物結(jié)合處，同時(shí)擔(dān)任底物的特異性識(shí)別，是非核糖體多肽合成開(kāi)始的起始處。NRPS基因常存在于合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因簇中，通過(guò)克隆NRPS基因，利用探針或已有生物學(xué)軟件能夠?qū)RPS基因簇結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析、結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，有助于尋找新型抗生素或生物活性物質(zhì)[6-9]，為相關(guān)新藥的研發(fā)提供新靶點(diǎn)和新思路。本研究是在前期已從海洋鏈霉菌L1基因組DNA克隆了NRPS縮合結(jié)構(gòu)域(即C結(jié)構(gòu)域)基因片段[10]的基礎(chǔ)上，開(kāi)展NRPS腺苷酰化結(jié)構(gòu)域的基因克隆，通過(guò)對(duì)所得基因序列及擬翻譯氨基酸序列的組成成分、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為后續(xù)研究A結(jié)構(gòu)域特異性和NRPS生物合成基因簇提供了理論依據(jù)，也為尋找新基因簇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源StreptomycesglobisporusL1為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；大腸埃希菌(Escherichiacoli) DH5 為大連工業(yè)大學(xué)分子實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，KNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，陳海水定容至1 L，重鉻酸鉀0.025 g，瓊脂20 g，pH 7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。②種子液培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨1.2 g，酵母提取物2 g，陳海水定容至1 L，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑與儀器TaqDNA聚合酶、DNA Marker、2×GC-rich PCR MasterMix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH I、pMD 19-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；引物合成及序列測(cè)定由北京六合華大基因科技有限公司完成。TaKaRa TP 600 PCR儀,日本TaKaRa公司；Chemi System UVP Bio-imaging System凝膠成像系統(tǒng), 美國(guó)UVP公司; Himac CR-21G高速冰凍離心機(jī), 日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 NRPS基因引物設(shè)計(jì)和合成 參考Gontang等[11]發(fā)布NRPS通用引物設(shè)計(jì)了用于克隆A結(jié)構(gòu)域基因片段的帶有酶切位點(diǎn)的引物：A2：5′-CGGGATCCTATCTACACCTCGGGATC-3′，下劃線部分為添加的BamH I酶切位點(diǎn)序列；A4：5′-CCAAGCTTGACGTCCCCCGTCCGGTAC-3′，下劃線部分為添加的Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)序列。

1.2.2 NRPS基因克隆及測(cè)序 以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的L1菌株基因組DNA為模板，以A2、A4為特異引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，通過(guò)梯度PCR確定最適退火溫度。PCR擴(kuò)增體系為2×GC-rich PCR MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性35 s，63 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化DH5 感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性單克隆進(jìn)行特異引物PCR和質(zhì)粒雙酶切檢測(cè)。重組質(zhì)粒送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 目的基因生物信息學(xué)分析 將測(cè)序的擴(kuò)增序列進(jìn)行BLAST搜索，確定擴(kuò)增序列正確性。利用ORF Finder進(jìn)行閱讀框查找與翻譯。利用BioEdit和ExPASy ProtParam在線工具預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)。SOPMA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)擬翻譯氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)分析。利用Swiss-Model工具進(jìn)行同源建模，分析其三維模擬結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NRPS基因克隆及核苷酸序列分析

以L1基因組DNA為模板，以A2、A4為特異引物進(jìn)行PCR的退火溫度優(yōu)化。當(dāng)退火溫度為63 ℃時(shí)能夠擴(kuò)增出一條750 bp左右的單一清晰條帶，與預(yù)期大小一致，因此確定63 ℃為擴(kuò)增的最適退火溫度。回收目的片段與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5 感受態(tài)細(xì)胞。提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行特異引物的PCR，在大約750 bp左右能夠擴(kuò)增出一條清晰整齊條帶(圖1)。

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行Hind III和BamH I雙酶切，同樣能夠得到約750 bp目的片段(圖2)，酶切片段與克隆目的片段大小相近，證明目的片段插入了pMD19-T克隆載體中。從測(cè)序結(jié)果得知，插入片段大小為715 bp，反向插入到pMD19-T載體中。在線BLAST比對(duì)表明，其與已發(fā)布的StreptomycesglobisporusC-1027的NRPS基因序列相似度達(dá)93%，證明擴(kuò)增的基因片段屬于NRPS基因的部分序列。

圖1 NRPS基因PCR擴(kuò)增電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplified NRPS gene1：DNA Marker IV；2：擴(kuò)增片段1: DNA Marker IV;2: amplified fragment from genomic DNA

圖2 NRPS重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the recombinant plasmid cut by Hind III and BamH I1: DNA Marker IV; 2: 重組質(zhì)粒; 3: Hind III和BamH I雙酶切質(zhì)粒1: DNA Marker IV; 2: recombinant plasmid; 3: the recombinant plasmid cut by Hind III and BamH I

2.2 NRPS基因編碼氨基酸序列分析

利用ORF Finder對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析，擬翻譯氨基酸序列為IYTSGSTGKPKGV-VTEYAGLTNMLINHQRRIFEPVLAEHGHRTFRIA-HTVSFAFDMSWEELLWLADGHEVHICDEELRRD-APRLVDYCLRHGIDVINVTPTYAQQLVAEGLLED-PERRPALVLLGGEAVTPTLWQRLAETEGTVGYN-LYGPTEYTINTLGVGTFECQDPVVGVAIDNTEVY-VLDPWLRPLPDGVPGELYVSGIGIARGYLGRSAQ-TAHRFVACPFGAPGERMYRTGDV

該序列含有238個(gè)氨基酸，屬于NRPS腺苷?；Y(jié)構(gòu)域序列的一部分，將此片段命名為A1。利用Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列中含有一個(gè)A結(jié)構(gòu)域特有的AFD_class_I superfamily核心結(jié)合區(qū)，此家族包括?；?、?；?CoA連接酶、非核糖體肽合成酶腺苷?；Y(jié)構(gòu)域和螢火蟲(chóng)熒光素酶(圖3)，在非核糖體肽合成酶腺苷?；Y(jié)構(gòu)域中，催化ATP依賴反應(yīng)。

選取與A1同源性較高的9個(gè)氨基酸序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示A1與Streptomycessp. EN27含有的NRPS處于同一分支，證明該序列為NRPS基因序列。

將該擬翻譯氨基酸序列與Streptomycessp. EN27的非核糖體肽合成酶進(jìn)行序列比對(duì)，同源性達(dá)到99%以上，證明擴(kuò)增序列的翻譯產(chǎn)物即為NRPS(圖5)。

利用在線網(wǎng)站PKS/NRPS Analysis Web-site (http://nrps.igs.umaryland.edu/)分析得出，該氨基酸片段A1屬于NRPS的A結(jié)構(gòu)域，這與在NCBI中Blast結(jié)果相一致，說(shuō)明A1片段確實(shí)屬于NRPS的A結(jié)構(gòu)域(圖6)。

通過(guò)模擬在其綁定位點(diǎn)中心區(qū)域，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)氨基酸殘基發(fā)揮催化作用，分別為DMWNLGLI。利用NRPS Predictive Blast工具(http://nrps.igs.umaryland.edu/blast.html)搜索具有該活性位點(diǎn)的NRPS，發(fā)現(xiàn)A1與含有SyrB-M1-Thr活性位點(diǎn)的NRPS相似度達(dá)到62%，說(shuō)明擴(kuò)增的基因片段為NRPS的A結(jié)構(gòu)域部分序列。

圖3 擴(kuò)增序列擬翻譯氨基酸結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 The putative amino acid domain analysis from amplified sequences

圖4 A結(jié)構(gòu)域進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建Fig.4 Construction of Adenylation domain evolutionary tree

圖5 A1擬翻譯氨基酸序列與Streptomyces sp. EN27 NRPS的比對(duì)Fig.5 The alignment of A1 amino acid sequence with Streptomyces sp. EN27 NRPS

2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析

跨膜結(jié)構(gòu)域一般由20個(gè)左右的疏水氨基酸殘基構(gòu)成，在膜中形成α-螺旋，其外部疏水側(cè)鏈通過(guò)范德華力與脂雙層分子脂肪酸鏈相互作用，是膜中蛋白與膜脂相結(jié)合的主要部位。對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析，對(duì)于推斷其在細(xì)胞中的作用部位具有重要意義。本研究應(yīng)用在線工具TMPred對(duì)A1進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析(圖7)，推斷出A1不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.4 疏水性親水性的預(yù)測(cè)和分析

采用Bioedit軟件預(yù)測(cè)NRPS基因編碼氨基酸序列理化性質(zhì)，得出該片段為親水性蛋白質(zhì)(圖8)。

根據(jù)ExPASy ProtParam在線分析得出：A1的氨基酸組成個(gè)數(shù)為238，理論分子量為26.36 kDa，等電點(diǎn)pI為5.06，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu) 31，帶正點(diǎn)荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys) 19。在280 nm波長(zhǎng)下，測(cè)得其水溶液消光系數(shù)為38 640 M-1cm-1，0.1%濃度的Abs為1.465。當(dāng)成熟肽N端為Ile時(shí)，半衰期在酵母體內(nèi)約為30 min，在大腸埃希菌體內(nèi)大于10 h。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.43，脂肪指數(shù)91.30；平均親水性系數(shù)(GRVAY)為-0.132。綜上，A1的不穩(wěn)定指數(shù)達(dá)到42.43，大于閾值40，表明A1為不穩(wěn)定蛋白。其負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)較多，故判斷為酸性蛋白質(zhì)。根據(jù)GRVAY數(shù)值-0.132推測(cè)A1為親水性蛋白質(zhì)，這與BioEdit軟件預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)一致。

圖8 A1親水性/疏水性分析Fig.8 Hydrophilicity/Hydrophobicity analysis results of A1

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈中相鄰多個(gè)氨基酸殘基形成的局部肽鏈空間，包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊片、延伸鏈及無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組成。

A1氨基酸序列的SOPMA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其α-螺旋占26.89%，β-轉(zhuǎn)角占10.50%，無(wú)規(guī)則卷曲占31.51%，伸展鏈占31.09%?？芍?螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是A1二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件，而β-轉(zhuǎn)角和伸展鏈則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中(圖9)。

圖9 A1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 The secondary structure prediction results of A1

2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析

應(yīng)用SWISS-MODEL在線對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模(圖10)。A1三維空間結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基本一致。其中5t3d.1.A模板與靶蛋白的相似性評(píng)估得分為35.22%，靶蛋白三維模型與數(shù)據(jù)庫(kù)中Enterobactin synthase component F的結(jié)構(gòu)相似。GMQE分值為0.71，QMEAN分值為-3.04，說(shuō)明靶蛋白模型與模板擬合度較高，靶蛋白模型可靠。靶蛋白與模板氨基酸的對(duì)應(yīng)序列(圖11)。初步判斷擴(kuò)增的腺苷?；Y(jié)構(gòu)域片段與Enterobactin synthase component F同源。為今后研究A1特異性與功能提供了重要參考，也為獲取相應(yīng)NRPS基因全長(zhǎng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖10 A1氨基酸片段3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 3D structure prediction of A1 amino acid fragment

圖11 A1三維建模序列Fig.11 The 3D modeling sequence of A1

3 討 論

A結(jié)構(gòu)域?qū)τ谡麄€(gè)NRPS是不可或缺的部分，在底物激活期間，A結(jié)構(gòu)域的小亞結(jié)構(gòu)域靠近大亞結(jié)構(gòu)域，形成閉合狀態(tài)[12]，旋轉(zhuǎn)140°為PCP硫醇化作用暴露出活性位點(diǎn)[13]。經(jīng)1/3催化周期完成后，A結(jié)構(gòu)域由閉合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)放狀態(tài)，此時(shí)允許底物進(jìn)行綁定[14]。Miller等[15]證明PCP結(jié)構(gòu)域與A結(jié)構(gòu)域相連區(qū)域，保守基序LPxP與A小亞結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的相互作用，從而縮短了連接區(qū)域的有效長(zhǎng)度。構(gòu)象改變驅(qū)使A結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)到PCP結(jié)構(gòu)域。在PCP結(jié)構(gòu)域的存在下，A結(jié)構(gòu)域催化效率大大提高[16-17]。而A結(jié)構(gòu)域在催化同時(shí)進(jìn)一步引導(dǎo)PCP結(jié)構(gòu)域移動(dòng)到A和C結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)上。這個(gè)周期運(yùn)動(dòng)由A結(jié)構(gòu)域更迭周期所調(diào)節(jié)。有證據(jù)表明在一個(gè)完整的NRPS模塊中，A結(jié)構(gòu)域能夠催化2個(gè)活化周期，其中一個(gè)加載到PCP結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)用于激活下一個(gè)氨基酸。當(dāng)上游缺少供體底物時(shí)，催化即刻停止[14]。結(jié)合觀察A結(jié)構(gòu)域狀態(tài)變化，如果非核糖體肽在C結(jié)構(gòu)域供體位點(diǎn)不可用，PCP結(jié)構(gòu)域與上游C結(jié)構(gòu)域相互作用的同時(shí)，會(huì)“凍結(jié)”A結(jié)構(gòu)域的腺苷?；饔谩Ｔ摍C(jī)制有很重要的調(diào)節(jié)意義，因?yàn)楸唤壎ǖ牡孜飶腜CP結(jié)構(gòu)域釋放之前，下一周期PCP是不可能成為巰基化狀態(tài)的[18]。鑒于A結(jié)構(gòu)域所具有的保守結(jié)構(gòu)，克隆NRPS的A結(jié)構(gòu)域序列對(duì)于探測(cè)NRPS基因的存在，并根據(jù)A結(jié)構(gòu)域序列信息預(yù)測(cè)肽骨架的結(jié)構(gòu)具有重要意義。本研究克隆了非核糖體肽合成酶A結(jié)構(gòu)域基因，為研究NRPS全序列乃至整個(gè)基因簇功能結(jié)構(gòu)提供參考。