劉彩玉 楊麗亞

[摘要]目的：研究蘿卜硫素對(duì)中波紫外線（UVB）照射后黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑素能力的抑制效應(yīng)及其對(duì)Traf6/TAK1信號(hào)傳導(dǎo)的影響。方法：采用人表皮黑素PIG1細(xì)胞為研究模型，分為對(duì)照組（Control）、模型組（Model，UVB照射）、蘿卜硫素處理組（10、20、40μM）。CCK8法分析PIG1細(xì)胞增殖情況，氫氧化鈉裂解法分析黑素含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分析優(yōu)黑素含量，Western blot技術(shù)檢測(cè)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1（TRP-1）、TRP-2、腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6（Traf6）及轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β-活化激酶1（TAK1）表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，UVB照射能誘導(dǎo)PIG1細(xì)胞黑素及優(yōu)黑素含量顯著升高（P<0.05），還能促使MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6及p-TAK1蛋白表達(dá)水平顯著增高（P<0.05）;與模型組比較，不同濃度蘿卜硫素能降低PIG1細(xì)胞黑素及優(yōu)黑素的生成（P<0.05），還能顯著抑制MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6及p-TAK1蛋白表達(dá)（P<0.05），呈現(xiàn)出劑量依賴性。結(jié)論：蘿卜硫素通過抑制Traf6/TAK1信號(hào)傳導(dǎo)降低UVB誘導(dǎo)PIG1細(xì)胞黑素生成。

[關(guān)鍵詞]蘿卜硫素;人表皮黑素細(xì)胞;黑素;信號(hào)通路;腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6;轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β-活化激酶1

[中圖分類號(hào)]R329.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）03-0096-04

Abstract： Objective? To study the suppressed effects of sulforaphane on ultraviolet radiation B（ UVB）-stimulated melanogenesis of melanocytes（PIG1）， and observe its effect on Traf6/TAK1 signal pathway. Methods? PIG1 cells were cultured in vitro and divided into control group， UVB group（Model group）， sulforaphane intervention groups（10，20 and 40μM）. The cell proliferation was determined by CKK8 assay. Melanin and eumelanin were detected by NaOH splitting and ELISA assay， respectively. The expression levels of microphthalmia-associated transcription factor（MITF）， tyrosinase（TYR）， tyrosinase-related protein-1（TRP-1）， TRP-2， tumor necrosis factor associated receptor factor 6（Traf6）， transforming growth factor-β activated kinase-1（TAK1） were measured by Western blot. Results? Compared with control group， the contents of melanin and eumelanin were significantly increased（P<0.05）; the expression levels of MITF， TYR， TRP-1， TRP-2， Traf6 and p-TAK1 in PIG1 cells were also significantly increased（P<0.05）. Compared with model group， the expression levels of MITF， TYR， TRP-1， TRP-2， Traf6 and p-TAK1 were significantly suppressed， and production of melanin and eumelanin reduced in a dose dependent manner in each sulforaphane intervention group（P<0.05）. Conclusion? Sulforaphane inhibits melanin and eumelanin production through down-regulating Traf6/TAK1 signal pathway in UVB-irradiated melanocytes.

Key words： sulforaphane; melanocytes; melanin; pathway; Traf6; TAK1

蘿卜硫素（Sulforaphane）又稱“萊菔子素”，屬于異硫代氰酸鹽衍生物，廣泛分布于西蘭花、花椰菜、甘藍(lán)、蘿卜及芥菜等十字花科植物。對(duì)蘿卜硫素藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥及參與免疫調(diào)節(jié)等功效[1-4]。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素具有防治皮膚癌的作用，還有很強(qiáng)的光防護(hù)作用，主要包括預(yù)防皮膚炎癥、紅斑、皮膚上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，光老化及皮膚腫瘤等[5]。人的皮膚長(zhǎng)期在紫外線下照射會(huì)引起色素沉積，適量的皮膚色素沉著對(duì)機(jī)體健康非常關(guān)鍵[6]，能夠防止皮膚細(xì)胞遭受紫外線輻射引起的損傷[7]。然而過多的色素沉積會(huì)引起色斑、雀斑等癥狀[8]。其中黑素的產(chǎn)生需要酪氨酸酶參與，紫外線照射會(huì)誘導(dǎo)酪氨酸酶表達(dá)增高[9]，進(jìn)而誘導(dǎo)黑素生成，因此降低酪氨酸酶的表達(dá)能夠抑制黑素的產(chǎn)生。然而，蘿卜硫素對(duì)皮膚黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑素能力的影響報(bào)道甚少。因此，本文研究蘿卜硫素對(duì)人表皮黑素PIG1細(xì)胞產(chǎn)生黑素及優(yōu)黑素的影響，并探討蘿卜硫素對(duì)Traf6/TAK1信號(hào)通路的影響。

1? 材料和方法

1.1 主要材料：原代正常人皮膚黑素細(xì)胞PIG1（來源于上海ATCC細(xì)胞庫(kù)）;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）;CCK8試劑盒（Solarbio公司）;RIPA裂解液（杭州四季青公司）;BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)）;兔抗鼠MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin抗體（Abcam公司）;羊抗兔IgG二抗（上海谷歌生物公司）;ELC化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（Advansta）;優(yōu)黑素試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器：BIORAD-550型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂公司）;BBS-V800型單人超凈臺(tái)（山東鑫貝西公司）;SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）;GE-100型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）;Amersham Imager 600儀器（BIO-RAD，美國(guó)）。

1.3 PIG1細(xì)胞培養(yǎng)：采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（不含抗生素）對(duì)PIG1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5% CO2、37℃恒溫。

1.4 UVB照射及蘿卜硫素處理：把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PIG1細(xì)胞接種至6孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，分為對(duì)照組（Control）、模型組（Model，UVB照射）、蘿卜硫素處理組（10、20、40μM）。待細(xì)胞生長(zhǎng)24h后，模型組和蘿卜硫素處理組細(xì)胞接受285～320nm波長(zhǎng)的UVB照射（30mJ/cm2），照射結(jié)束后更換含不同濃度蘿卜硫素的新鮮培養(yǎng)液。連續(xù)UVB照射3d，末次照射后24h進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 CCK8實(shí)驗(yàn)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PIG1細(xì)胞接種至96孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度蘿卜硫素（0、1、5、10、20、40、60、80、100μM）處理細(xì)胞24h。除去舊培養(yǎng)液，每孔加入20μl CCK8試劑，放于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，置于450nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀中檢測(cè)細(xì)胞吸光度A值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.6 黑素檢測(cè)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PIG1細(xì)胞接種至6孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，按照“1.4”中的方法處理細(xì)胞，UVB照射及蘿卜硫素干預(yù)完成后，收集細(xì)胞，加入200μl含10% DMSO的NaOH（1mol/L）溶液，水浴（90℃，1h），置于405nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀中檢測(cè)各孔細(xì)胞吸光度A值。

1.7 優(yōu)黑素檢測(cè)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PIG1細(xì)胞接種至6孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，按照“1.4”中的方法處理細(xì)胞，UVB照射及蘿卜硫素干預(yù)完成后，收集細(xì)胞加入裂解液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)每個(gè)樣品蛋白濃度一致后，采用ELISA試劑盒檢測(cè)優(yōu)黑素含量。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)：收集“1.7”中細(xì)胞裂解液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度后，每孔上樣50μg進(jìn)行凝膠電泳（恒壓70V，3h），待蛋白完全分離后進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)（恒流275mA，70min），5%脫脂牛奶封閉蛋白條帶1h后，孵育一抗（MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin，稀釋比1‥1 000）4℃過夜，TBST洗膜3次，室溫孵育二抗（稀釋比1‥3 000）90min，TBST洗膜3次，ECL顯色，黑室曝光。蛋白條帶灰度值采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2? 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素對(duì)PIG1細(xì)胞增殖的影響：0μM處理組用含1.2‰ DMSO培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞，結(jié)果提示與對(duì)照組相比未發(fā)生明顯變化，說明培養(yǎng)液中1.2‰含量的DMSO對(duì)PIG1細(xì)胞增殖沒有影響。蘿卜硫素濃度小于60μM時(shí)，細(xì)胞相對(duì)存活率沒有發(fā)生顯著變化，但濃度高于60μM時(shí)，隨著蘿卜硫素劑量的升高細(xì)胞存活率顯著降低，當(dāng)蘿卜硫素劑量為60、80、100μM時(shí)細(xì)胞存活率分別降低（12.3±3.1）%、（18.6±3.9）%、（25.1±4.3）%。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇低（10μM）、中（20μM）、高（40μM）3種劑量蘿卜硫素。不同劑量蘿卜硫素對(duì)PIG1細(xì)胞相對(duì)存活率影響見圖1。

2.2 蘿卜硫素對(duì)PIG1細(xì)胞黑素生成的影響：與對(duì)照組（Control）相比，模型組（Model）中PIG1細(xì)胞黑素生成量顯著增高（P<0.05）;低、中、高濃度蘿卜硫素組中黑素含量相對(duì)于模型組分別降低（10.6±3.7）%、（20.0±3.8）%、（29.6±5.1）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蘿卜硫素對(duì)PIG1細(xì)胞黑素生成的抑制作用見圖2。

2.3 蘿卜硫素對(duì)PIG1細(xì)胞優(yōu)黑素生成的影響：與對(duì)照組（Control）相比，模型組（Model）中PIG1細(xì)胞優(yōu)黑素生成量顯著增高（P<0.05）;低、中、高濃度蘿卜硫素組中優(yōu)黑素含量相對(duì)于模型組分別降低（22.2±4.2）%、（37.0±4.9）%、（48.1±5.6）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蘿卜硫素對(duì)PIG1細(xì)胞優(yōu)黑素產(chǎn)生的抑制作用見圖3。

2.4 蘿卜硫素對(duì)PIG1細(xì)胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表達(dá)的影響：模型組細(xì)胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量蘿卜硫素組細(xì)胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表達(dá)均顯著降低，差異比較有顯著性（P<0.05）。研究還發(fā)現(xiàn)TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表達(dá)隨蘿卜硫素濃度增高而降低，表現(xiàn)出劑量依賴性，各藥物組比較差異有顯著性（F=13.068，P<0.05）。各組間TYR、TRP1、TRP2及MITF蛋白表達(dá)水平見圖4，表1。

2.5 蘿卜硫素對(duì)PIG1細(xì)胞中Traf6/TAK1信號(hào)通路的影響：模型組細(xì)胞中Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯增高，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量蘿卜硫素組細(xì)胞中Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有顯著性（P<0.05）。研究還發(fā)現(xiàn)Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)隨蘿卜硫素濃度增高而降低，表現(xiàn)出劑量依賴性，各藥物組比較差異有顯著性（F=12.507，P<0.05）;而TAK1蛋白在各組細(xì)胞中表達(dá)無明顯變化。各組間Traf6、TAK1、p-TAK1蛋白表達(dá)水平見圖5，表2。

3? 討論

人皮膚組織含有兩種類型黑素，即優(yōu)黑素及褐黑素[10]。優(yōu)黑素發(fā)揮的生物學(xué)作用相對(duì)褐黑素稍強(qiáng)，前者可以防止UVB照射降解黑素細(xì)胞。黑素沉積時(shí)優(yōu)黑素水平增高，褐黑素水平降低，而且優(yōu)黑素還能向褐黑素轉(zhuǎn)化[11]，進(jìn)而降低黑素含量。研究報(bào)道MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白均與黑素產(chǎn)生有直接關(guān)系[12]，酪氨酸酶相關(guān)的酶不僅誘導(dǎo)黑素產(chǎn)生導(dǎo)致皮膚色素沉積，而且介導(dǎo)了哺乳動(dòng)物皮膚色素沉積紊亂[13]。因此，抑制黑素產(chǎn)生相關(guān)蛋白的活性是阻止色素沉積的重要途徑。黑素沉積的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具有頑固性和復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)紫外線日曬在其發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)考察了蘿卜硫素處理紫外線照射的PIG1細(xì)胞后，分析了細(xì)胞中黑素含量及MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果提示，UVB照射后PIG1細(xì)胞黑素水平明顯增高;而蘿卜硫素能呈濃度依賴性抑制UVB照射誘導(dǎo)的黑素產(chǎn)生。Western blot結(jié)果說明UVB照射可誘導(dǎo)PIG1細(xì)胞中MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表達(dá)量的增高，而蘿卜硫素處理后可以呈濃度依賴性地抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)。提示蘿卜硫素可通過抑制酪氨酸酶相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而降低PIG1細(xì)胞中黑素的產(chǎn)生。

腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6（Traf6）廣泛分布于多種組織中，可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)[15]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞在非活躍狀態(tài)下能夠低表達(dá)Traf6，而在黑素瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)[16]，并且在UVB照射等刺激下能夠誘導(dǎo)Traf6表達(dá)上調(diào)[17-18]。亦有研究提示，蘿卜硫素能通過抑制Traf6信號(hào)傳導(dǎo)降低豬肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[19]。早期研究已提出Traf6信號(hào)活化能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β-活化激酶1（TAK1）磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮多種生物學(xué)作用，包括調(diào)節(jié)增殖、黏附、分化，和生存等細(xì)胞過程[20]。已有研究表明TAK1磷酸化后能與MITF發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)MITF表達(dá)[21]。但是，本文缺乏相關(guān)研究來證實(shí)蘿卜硫素誘導(dǎo)MITF表達(dá)下調(diào)是由于Traf6/TAK1信號(hào)傳導(dǎo)的抑制，無法得出Traf6/TAK1信號(hào)通路與MITF的上下游關(guān)系。因此，后期將會(huì)采用Traf6/TAK1信號(hào)通路抑制劑或激動(dòng)劑干預(yù)黑素細(xì)胞，來探討蘿卜硫素是否通過調(diào)控Traf6/TAK1信號(hào)通路介導(dǎo)MITF表達(dá)，進(jìn)而改變黑素的產(chǎn)生。

上述研究結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)Traf6/TAK1信號(hào)通路很可能是蘿卜硫素影響黑素細(xì)胞黑素產(chǎn)生的重要機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，UVB照射可誘導(dǎo)PIG1細(xì)胞中Traf6和p-TAK1蛋白的表達(dá)，而蘿卜硫素處理后可以呈濃度依賴性地抑制Traf6和p-TAK1蛋白的表達(dá)。提示蘿卜硫素可通過抑制Traf6/TAK1信號(hào)通路活化進(jìn)而降低PIG1細(xì)胞中黑素的產(chǎn)生。

總之，蘿卜硫素抑制UVB照射誘導(dǎo)的黑素生成的藥理作用，可能與其通過抑制Traf6/TAK1信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而降低MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表達(dá)有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于加深對(duì)藥物治療機(jī)制的理解，為皮膚黑素沉積疾病的臨床治療提供理論參考。然而黑素產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，在蘿卜硫素降低黑素產(chǎn)生的過程中，是否還有其他信號(hào)通路的參與還需進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2018-12-13

本文引用格式：劉彩玉，楊麗亞.蘿卜硫素通過下調(diào)Traf6/TAK1信號(hào)傳導(dǎo)抑制UVB誘導(dǎo)黑素生成的機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2019，28（3）：96-99.