(1.海正藥業(yè)(杭州)有限公司，浙江 杭州 311404；2.浙江奕格資產(chǎn)管理有限公司，浙江 杭州 310051)

沙美特羅氟替卡松吸入劑為白色或類白色的微粉，密封在鋁箔條內(nèi)的吸入粉霧制劑[1-2]。該鋁箔條纏繞在一模制的塑料裝置中，這種給藥裝置稱為準(zhǔn)納器(Diskus)[3]?；颊咄ㄟ^(guò)準(zhǔn)納器吸嘴將藥物吸至肺部，適應(yīng)癥為哮喘，該品為非無(wú)菌產(chǎn)品[4]。該品通用名為沙美特羅氟替卡松(salmeterol/fluticasone)吸入劑。商品名為舒利迭(Seretide)吸入劑，原研廠家為英國(guó)葛蘭素史克(GSK)[5-6]。該品由昔萘酸沙美特羅和丙酸氟替卡松組成[7]。原料藥(API)為昔萘酸沙美特羅和丙酸氟替卡松兩種，昔萘酸沙美特羅化學(xué)名為2-(羥甲基)-4-[1-羥基-2-[6-(4-苯基丁氧)己基氨基]乙基]-苯酚，難溶于水，其結(jié)構(gòu)表達(dá)式為C25H37NO4；丙酸氟替卡松化學(xué)名為6，9-二氟-11-羥-16-甲基-3-氧代-17-(1-氧代丙氧基)-雄甾-1，4-二烯-17-硫代羧酸(6a，11b，16a，17a)-S-(氟甲基)酯，難溶于水，其結(jié)構(gòu)表達(dá)式為C25H31F3O5S。沙美特羅結(jié)構(gòu)式中帶3個(gè)羧基，在溶液中呈酸性可能對(duì)微生物生長(zhǎng)有抑制作用[8]。藥品質(zhì)量控制是藥品生產(chǎn)上市前的最后一道關(guān)卡，采取正確的檢測(cè)方法呈現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量是藥品質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室的工作重心，微生物檢測(cè)控制是藥品質(zhì)量控制的一個(gè)重要項(xiàng)目[9-11]。根據(jù)美國(guó)藥典，吸入劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為需氧菌總數(shù)≤200 cfu/g、霉菌和酵母菌總數(shù)≤20 cfu/g，特定微生物(1 g或1 mL)不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和耐膽鹽革蘭陰性菌[12]。而根據(jù)美國(guó)藥典沙美特羅替卡松吸入劑個(gè)論，該品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為需氧菌總數(shù)≤20 cfu/g、霉菌和酵母菌總數(shù)≤20 cuf/g，特定微生物不得檢出大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌[13-14]。因此，該品為微生物控制最嚴(yán)格的非無(wú)菌產(chǎn)品，加上難溶于水且可能存在抑菌作用，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)描述其微生物檢測(cè)的方法。筆者通過(guò)添加中和劑增強(qiáng)溶解性、薄膜過(guò)濾法去除抑菌性等途徑確定了適合該品的微生物限度檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 樣 品

沙美特羅替卡松吸入劑，海正藥業(yè)(杭州)有限公司吸入藥分公司(批號(hào)為18030401)。

1.2 儀器設(shè)備

生物安全柜，上海力康公司；滅菌鍋，ALP；電子天平，梅特勒；培養(yǎng)箱，賓得；三聯(lián)過(guò)濾器，默克；移液槍，艾本德。

1.3 菌 株

菌株來(lái)源為美國(guó)典型菌株保藏中心(ATCC)的商業(yè)定量菌株，廠家為Mecconti。包括大腸埃希菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌((SalmonellaparatyphiB)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaablicans)和黑曲霉霉(Asperllusniger)等。

1.4 菌懸液

分別取上述各1顆定量菌株小管及溶解液瓶，平衡至室溫25 ℃，將菌株顆粒倒入溶解液瓶，34～38 ℃培養(yǎng)30 min，用漩渦振蕩器混勻，得到<100 cfu/mL的菌懸液，該菌懸液在2～8 ℃可保存8 h[15-16]。

1.5 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基廠家為默克，包括TSA(胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基)，SDA(沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)，TSB(胰酪胨大豆液體培養(yǎng)基)，SDB(沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基)，MCA(麥康凱瓊脂培養(yǎng)基)，MSA(甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基)，CA(溴代十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基)，MCB(麥康凱肉湯培養(yǎng)基)，RVSEB(氯化鎂孔雀綠增菌培養(yǎng)基)，XLDA(木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基)和pH為7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液等。

1.6 微生物限度檢查法計(jì)數(shù)法檢測(cè)方法

采用美國(guó)藥典第61～62章節(jié)的方法進(jìn)行研究，計(jì)數(shù)法需要進(jìn)行回收率計(jì)算，特定微生物需要觀察菌落特征。若在產(chǎn)品放行檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)特定微生物，則需要采取進(jìn)一步進(jìn)行菌株鑒定[17-18]。

1.6.1 常規(guī)法

取裝置數(shù)個(gè)，拆開(kāi)裝置撕開(kāi)鋁箔條取出粉末供試品，稱重5 g，加入100 mL緩沖液中，充分混勻溶解，制備試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組和稀釋級(jí)對(duì)照組。

試驗(yàn)組：取1 mL注入空平皿中，加入<100 cfu菌懸液。

菌液組：分別取制備好的菌懸液1 mL放于不同的空平皿中。

供試品對(duì)照組：操作方法同試驗(yàn)組但不加入試驗(yàn)菌。

稀釋劑對(duì)照組：取1 mL緩沖液放于空平皿中。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌加入融化的且不超過(guò)45 ℃的TSA，待凝固后32.5 ℃培養(yǎng)3 d；白色念珠菌和黑曲霉加入融化的不超過(guò)45 ℃的SDA，待凝固后22.5 ℃培養(yǎng)5 d。進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，分別計(jì)算各個(gè)菌的回收率。

1.6.2 薄膜過(guò)濾法

取裝置數(shù)個(gè)，拆開(kāi)裝置撕開(kāi)鋁箔條取出粉末供試品，稱重5 g，加入100 mL緩沖液，充分混勻溶解，為供試液。制備試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組和稀釋劑對(duì)照組。

試驗(yàn)組：取10 mL供試液至濾杯中，注入50 mL緩沖液中，薄膜過(guò)濾，沖洗液100 mL/膜，在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌，并過(guò)濾。

菌液組：分別取制備好的菌液1 mL到濾杯中，加入50 mL緩沖液，過(guò)濾。

供試品對(duì)照組：操作方法同試驗(yàn)組但不加入試驗(yàn)菌。

稀釋劑對(duì)照組：取緩沖液1 mL到濾杯中，加入50 mL緩沖液，以下操作同試驗(yàn)組。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌取下膜貼于TSA平板中，32.5 ℃培養(yǎng)3 d。白色念珠菌和黑曲霉取下膜貼于SDA平板中，22.5 ℃培養(yǎng)5 d。進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，分別計(jì)算各個(gè)菌的回收率。

1.6.3 薄膜過(guò)濾法加中和劑

取裝置數(shù)個(gè)，拆開(kāi)裝置撕開(kāi)鋁箔條取出粉末供試品，稱重5 g，稱重0.1 g中和劑吐溫80，加入100 mL緩沖液混勻溶解，制成供試液。制備試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組和稀釋劑對(duì)照組。

試驗(yàn)組：取10 mL供試液至濾杯中，加入50 mL緩沖液，薄膜過(guò)濾，沖洗液為100 mL/次，沖洗1次，在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌，并過(guò)濾。

菌液組：分別取制備好的菌液1 mL到濾杯中，加入50 mL緩沖液，過(guò)濾。

供試品對(duì)照組：操作方法同試驗(yàn)組但不加入試驗(yàn)菌。

稀釋劑對(duì)照組：取緩沖液1 mL到濾杯中，加入50 mL緩沖液，以下操作同試驗(yàn)組。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌取下膜貼于TSA平板中，32.5 ℃培養(yǎng)3 d；白色念珠菌和黑曲霉取下膜貼于SDA平板中，22.5 ℃培養(yǎng)5 d。進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，分別計(jì)算各個(gè)菌的回收率。

1.7 微生物限度檢查法特定微生物檢測(cè)方法

1.7.1 大腸埃希菌

稱取4 g樣品，加入10 mL緩沖液，再加入0.08 g中和劑吐溫80，振蕩2 min，最后加入70 mL緩沖液，振蕩1 min，靜置10 min。取上述供試液20 mL，接種到100 mL TSB中，混合，再向制備的試驗(yàn)組中加入<100 cfu的大腸埃希菌菌懸液，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。從試驗(yàn)組培養(yǎng)后的TSB中，移取1 mL培養(yǎng)物加到100 mL麥康凱肉湯中，42～44 ℃培養(yǎng)24 h。然后使用接種環(huán)從麥康凱肉湯的培養(yǎng)物中，挑取少許培養(yǎng)物在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接種，制備1個(gè)平皿，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取20 mL緩沖液代替供試液進(jìn)行試驗(yàn)，作為陰性對(duì)照組。

如果在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上發(fā)現(xiàn)紅色塊狀物及可能環(huán)繞著膽汁沉淀環(huán)的菌落特征，則試驗(yàn)組中檢出大腸埃希菌，在本實(shí)驗(yàn)室條件下該方法適用。同時(shí)陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)不得檢出。

1.7.2 沙門氏菌

稱取4 g樣品，加入10 mL緩沖液，再加入0.08 g中和劑吐溫80，振蕩2 min，最后加入70 mL緩沖液，振蕩1 min，靜置10 min。取上述供試液20 mL，接種到100 mL TSB，混勻，再向制備的試驗(yàn)組中加入<100 cfu的沙門氏菌菌懸液，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。移取0.1 mL TSB轉(zhuǎn)移到10 mL的氯化鎂孔雀綠沙門氏菌增菌肉湯上，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。使用接種環(huán)從氯化鎂孔雀綠沙門氏菌增菌肉湯的培養(yǎng)物中，挑取少許培養(yǎng)物在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板劃線接種，制備1個(gè)平皿，于30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取20 mL緩沖液代替供試液進(jìn)行試驗(yàn)，作為陰性對(duì)照組。

如果在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上發(fā)現(xiàn)帶或不帶黑心的發(fā)育良好的紅色的菌落特征，則試驗(yàn)組中檢出沙門氏菌，在本實(shí)驗(yàn)室條件下該方法適用。同時(shí)陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)不得檢出。

1.7.3 金黃色葡萄球菌

稱取4 g樣品，加入10 mL緩沖液，再加入0.08 g中和劑吐溫80，振蕩2 min，最后加入70 mL緩沖液，振蕩1 min，靜置10 min。取上述供試液20 mL，接種到100 mL TSB，混勻，再向制備的試驗(yàn)組中加入<100 cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。然后使用接種環(huán)從TSB培養(yǎng)物中，挑取少許培養(yǎng)物在甘露醇氯化鈉瓊脂平板劃線接種，制備1個(gè)平皿，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取20 mL緩沖液代替供試液進(jìn)行試驗(yàn)，作為陰性對(duì)照組。

如果在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上發(fā)現(xiàn)黃色區(qū)帶環(huán)繞的黃色或白色的菌落特征，則試驗(yàn)組中檢出金黃色葡萄球菌，在本實(shí)驗(yàn)室條件下該方法適用。同時(shí)陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)不得檢出。

1.7.4 銅綠假單胞菌

稱取4 g樣品，加入10 mL緩沖液，再加入0.08 g中和劑吐溫80，振蕩2 min，最后加入70 mL緩沖液中，振蕩1 min，靜置10 min。取上述供試液20 mL，接種到100 mL TSB，混合，再向制備的試驗(yàn)組中加入<100 cfu的銅綠假單胞菌菌懸液。30～35 ℃培養(yǎng)18 h。然后使用接種環(huán)從TSB培養(yǎng)物中，挑取少許培養(yǎng)物在溴代十六烷基三甲銨瓊脂平板劃線接種，制備1個(gè)平皿，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取20 mL緩沖液代替供試液進(jìn)行試驗(yàn)，作為陰性對(duì)照組。

如果在溴代十六烷基三甲銨瓊脂平板上發(fā)現(xiàn)綠色熒光環(huán)圍繞的菌落特征，則試驗(yàn)組中檢出銅綠假單胞菌，在本實(shí)驗(yàn)室條件下該方法適用。同時(shí)陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)不得檢出。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物限度檢查法計(jì)數(shù)法結(jié)果與分析

2.1.1 結(jié) 果

微生物限度檢查法中的計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)為定量實(shí)驗(yàn)，回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能由于樣品存在不溶性、抑菌性等而不符合標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)法、薄膜過(guò)濾法和薄膜過(guò)濾法加中和劑的各個(gè)菌回收率結(jié)果如表1所示。

注：1) 組1為試驗(yàn)組；組2為稀釋劑對(duì)照組。

2.1.2 分 析

常規(guī)法3次試驗(yàn)結(jié)果表明，白色念珠菌和黑曲霉的試驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組的回收率均低于50%，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組回收率均高于50%。由于樣品的抑菌性，對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響，故霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)不可用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

薄膜過(guò)濾法3次試驗(yàn)結(jié)果表明，平板上有很厚的樣品鋪在薄膜上且白色念珠菌和黑曲霉的試驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組的回收率均低于50%，而金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌試驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組的回收率均高于50%。由于樣品溶解性低，對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響，故霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)不可用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢查。

薄膜過(guò)濾法加中和劑3次平行試驗(yàn)結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)組和稀釋劑對(duì)照組的回收率均高于50%。說(shuō)明加入中和劑能增加溶解性且通過(guò)薄膜過(guò)濾法能去除了抑菌性，可以采用薄膜過(guò)濾法加中和劑進(jìn)行微生物限度檢查法計(jì)數(shù)法檢查。

通過(guò)上述3組試驗(yàn)，確定了通過(guò)薄膜過(guò)濾法加中和劑進(jìn)行5種菌株的回收率測(cè)試，回收率結(jié)果符合要求。故沙美特羅替卡松吸入劑可采用薄膜過(guò)濾法加中和劑進(jìn)行方法確認(rèn)及相應(yīng)產(chǎn)品的放行測(cè)試。

2.2 微生物限度檢查法特定微生物結(jié)果與分析

2.2.1 結(jié) 果

微生物限度檢查法中的特定微生物檢查實(shí)驗(yàn)為定性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)和特定瓊脂培養(yǎng)等步驟確定樣品中不得含有某種微生物。因此，通過(guò)計(jì)數(shù)法結(jié)果得知，雖然某幾個(gè)微生物生長(zhǎng)會(huì)受抑制，但是結(jié)果是有微生物生長(zhǎng)。因此采用常規(guī)的方法進(jìn)行特定微生物檢查實(shí)驗(yàn)，所有特定微生物培養(yǎng)結(jié)果如表2所示。

注：1) “+”為陽(yáng)性；“-”為陰性。

2.2.2 分 析

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等4個(gè)特定微生物檢查結(jié)果試驗(yàn)組都呈陽(yáng)性，陰性對(duì)照都呈陰性。故該4個(gè)特定微生物檢測(cè)可采用相應(yīng)的方法進(jìn)行方法確認(rèn)及相應(yīng)產(chǎn)品的放行測(cè)試。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙美特羅替卡松吸入劑溶解性低，且有較強(qiáng)的抑菌作用。采用常規(guī)方法、薄膜過(guò)濾法進(jìn)行微生物限度檢查法確認(rèn)，白色念珠菌和黑曲霉兩株陽(yáng)性菌株的試驗(yàn)組和稀釋級(jí)對(duì)照組的回收率均未達(dá)到50%。經(jīng)過(guò)研究，確定沙美特羅替卡松吸入劑微生物限度檢查法采用薄膜過(guò)濾法加中和劑增強(qiáng)溶解性、去除抑菌作用，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)法檢查。特定微生物大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌采用相應(yīng)的方法進(jìn)行微生物限度檢查法特定微生物檢查。