(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

腺苷(Adenosine)全稱為9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，也稱作腺嘌呤核苷[1-2]，是一種具有重要生理、生化功能的內(nèi)源性嘌呤核苷[3-4]。利用生物合成法中的微生物發(fā)酵生產(chǎn)腺苷有很大的優(yōu)勢[3]。早期，施慶珊等[5]對營養(yǎng)缺陷型的產(chǎn)腺苷菌株做了誘變研究，王小茹等[6]通過選育抗代謝類似物8-氮鳥嘌呤提高了腺苷的產(chǎn)量。目前利用發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的主要目的是通過誘變手段來提高產(chǎn)量。ARTP中富含的氮分子二正系統(tǒng)、氮分子一負(fù)系統(tǒng)、激發(fā)態(tài)氦原子、氫原子、氧原子和OH等活性能量離子，會(huì)對微生物菌株、植物和動(dòng)物的遺傳物質(zhì)造成損傷，并能夠誘發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制[7]。而SOS修復(fù)是一種高容錯(cuò)率的修復(fù)，修復(fù)過程中會(huì)產(chǎn)生種類豐富的錯(cuò)配位點(diǎn)，最終穩(wěn)定遺傳。ARTP誘變具有低成本、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)誘變方法相比，ARTP誘變對遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制多種多樣，因而獲得突變型的多樣性也隨之增多，ARTP誘變的特點(diǎn)在應(yīng)對微生物的誘變育種時(shí)顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。ARTP誘變對環(huán)境無污染，無論用何種氣體放電，均無有害氣體產(chǎn)生，且放電過程中沒有核聚變和裂變等反應(yīng)，存在的僅是從幾十納米波長到紫外光線、可見光線甚至更強(qiáng)的光線產(chǎn)生，這種長波的光線與輻射射線不同，其對人體損傷較小。紫外誘變使DNA分子形成嘧啶二聚體，二聚體出現(xiàn)會(huì)減弱雙鍵間氫鍵的作用，并使雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，阻礙堿基間的正常配對，從而有可能引起突變或死亡[8]。另外二聚體的形成，會(huì)妨礙雙鏈的解開，進(jìn)而引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失。次黃嘌呤是合成腺苷的重要前體，6-巰基嘌呤(6-MP)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與次黃嘌呤相似，兩者唯一的不同是次黃嘌呤分子中6位C上的羥基被巰基取代，6-MP則通過競爭性抑制次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，使5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)分子中的磷酸核糖不能向鳥嘌呤及次黃嘌呤轉(zhuǎn)移，從而阻斷嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成途徑。6-MP可在體內(nèi)經(jīng)酶的作用磷酸核糖化生成6-MP核苷酸，并以這種形式抑制肌苷酸(IMP)轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘账?AMP)及鳥苷酸(GMP)的反應(yīng)[9]。由于6-MP核苷酸結(jié)構(gòu)與IMP相似，因此能反饋抑制PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶從而干擾磷酸核糖胺的形成，阻斷嘌呤核苷酸的從頭合成途徑。筆者通過對腺苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌進(jìn)行ARTP誘變和紫外-LiCl誘變并結(jié)合腺苷合成前體次黃嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物6-MP抗性理性來篩選腺苷高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

枯草芽孢桿菌B.subtilis4.8(命名為BS-0)。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(100 mL)：葡萄糖1 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，牛肉膏1 g，尿素0.5 g，氯化鈉0.25 g，瓊脂粉2 g，pH 7.2。

種子培養(yǎng)基(100 mL)：葡萄糖1 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，牛肉膏0.3 g，尿素0.5 g，氯化鈉0.25 g，泡敵0.03 g，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(100 mL)：葡萄糖12 g，酵母膏1.6 g，磷酸二氫鉀0.3 g，七水硫酸鎂0.1 g，尿素0.5 g，氯化鉀0.2 g，硫酸銨1.5 g，一水硫酸錳0.001 g，硫胺素0.015 g，豆餅分水解液1.5 g，泡敵0.03 g，消后pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化及保種

擊破安瓿管后用0.5～1.0 mL無菌水溶解枯草芽孢桿菌凍干粉并混勻，取適量溶解混勻后的凍干粉用V(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的甘油)∶V(凍干粉)=1∶1混勻后保存于-80 ℃冰箱中。用接種環(huán)蘸取適量混勻后的凍干粉液在斜面培養(yǎng)基上劃線，35 ℃培養(yǎng)1～2 d，4 ℃冰箱中保存待用，保存期限不超過15 d。

1.2.2 搖瓶種子及菌懸液的制備

用接種環(huán)無菌操作挑取斜面培養(yǎng)基中的單菌落接入30 mL種子培養(yǎng)基，于37 ℃，220 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。

取1 mL對數(shù)期菌液5 000 r/min離心1 min，取上清，用等量生理鹽水垂懸洗滌沉淀，稀釋，使OD600至0.6～0.8。

1.2.3 抗性濃度選擇

取100 μL菌懸液涂布在質(zhì)量濃度為0，0.20，0.40，0.60，0.75，0.78，0.80 g/L的6-MP的固體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察含不同6-MP濃度平板上菌落生長情況，計(jì)數(shù)并記錄未長菌落的平板中含有的6-MP最低濃度，該濃度即為枯草芽孢桿菌的最低致死濃度[10]。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件

取對數(shù)期的種子液以6%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行，控制搖床溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速240 r/min，連續(xù)培養(yǎng)3 d，測定其腺苷產(chǎn)量。

1.2.5 腺苷含量的測定

取發(fā)酵液煮沸5 min，冷卻至室溫后3 000 r/min離心10 min，精密量取5 μL離心上清加入到5 mL濃度為0.1 mol/L，pH為3的鹽酸溶液中混勻，測其260 nm處的吸光度。

1.2.6 ARTP誘變處理

ARTP誘變：準(zhǔn)備6個(gè)1.5 mL的EP管，每管加入990 μL無菌生理鹽水，將EP管標(biāo)記后卡在ARTP誘變儀卡槽內(nèi)，紫外照射20 min以使待誘變環(huán)境處于無菌狀態(tài)。紫外滅菌結(jié)束后取10 μL菌懸液均勻鋪在ARTP載片上，用尖頭鑷子將鋪有菌液的載片轉(zhuǎn)移至凹槽中，每個(gè)載片對應(yīng)一個(gè)EP管。設(shè)置誘變時(shí)間為0，15，30，45，60，75，90 s，放電功率為120 W，氣流量為10 SLM。全部誘變結(jié)束后，載片落入EP管中，將EP管在漩渦振蕩儀中振蕩洗脫1～2 min以洗掉載片上的菌體，將含有菌液的EP管放置于-4 ℃冰箱中低溫保持2 h，使其自生不能對突變產(chǎn)生修復(fù)[11-12]，之后進(jìn)行適當(dāng)稀釋并取100 μL分別涂布于無6-MP抗性的固體培養(yǎng)基和6-MP質(zhì)量濃度為0.78 g/L的固體培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行，35 ℃培養(yǎng)1～2 d，分別計(jì)算致死率和正突變率，表達(dá)式為

致死率=(1-B/A)×100%

正突變率=C/B×100%

式中：A為照射0 s平板上菌落數(shù)均值；B為各照射時(shí)間無抗性平板上菌落數(shù)均值；C為各照射時(shí)間含最低致死濃度6-MP抗性平板上菌落均值。

1.2.7 紫外-LiCl誘變

取5 mL菌懸液和無菌磁力轉(zhuǎn)子置于無菌平皿中，用磁力攪拌器使菌懸液始終處于被攪拌狀態(tài)，保持紫外燈對含菌懸液和磁力轉(zhuǎn)子的平皿垂直照射距離為20～30 cm[12]，在照射時(shí)間為0，40，80，120，160，200，240 s時(shí)快速取菌液1mL并置于暗處，待誘變結(jié)束后在紅光下對誘變過的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋[13]，適當(dāng)稀釋后分別取100 μL涂布于LiCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的無6-MP抗性的固體培養(yǎng)基和LiCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%，6-MP質(zhì)量濃度為0.8 g/L的固體培養(yǎng)基中(LiCl均在固體培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右時(shí)加入，待混勻后倒平板)，每組3個(gè)平行，35 ℃避光培養(yǎng)1～2 d。致死率及正突變率[14-15]的算法參考1.2.6。

1.2.8 ARTP結(jié)合紫外-LiCl誘變

將菌懸液進(jìn)行ARTP誘變處理后低溫放置2 h，并培養(yǎng)4 h后進(jìn)行紫外誘變、稀釋并涂布于LiCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的無6-MP抗性的固體培養(yǎng)基和LiCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%，6-MP質(zhì)量濃度為0.85 g/L的固體培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行，35 ℃避光培養(yǎng)1～2 d。

1.2.9 腺苷高產(chǎn)菌的發(fā)酵篩選

初篩：挑取抗性正突變菌落和對照菌落接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后以6%的接種量轉(zhuǎn)接到24孔板的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行，37 ℃，240 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后，測其腺苷產(chǎn)量，測定方法參考1.2.5。

復(fù)篩：挑取初篩產(chǎn)量高的菌株接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后以6%的接種量轉(zhuǎn)接到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行，37 ℃，240 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后，測其腺苷產(chǎn)量，測定方法參考1.2.5。

1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對誘變篩選后的高產(chǎn)量菌株進(jìn)行種子活化和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測其腺苷產(chǎn)量，傳代考察其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性濃度測定

以對照組即6-MP抗性濃度為0的平板上菌落的大小和數(shù)目為菌落生長狀況標(biāo)準(zhǔn)，將含不同6-MP抗性濃度的實(shí)驗(yàn)組平板上的菌落生長狀況與之比較。由表1可知，隨著抗性濃度的增大，枯草芽孢桿菌單菌落數(shù)逐漸減少，菌落大小也明顯受6-MP濃度影響，當(dāng)6-MP質(zhì)量濃度增大到0.75 g/L時(shí)，單菌落較少且體積小，6-MP質(zhì)量濃度增大到0.78 g/L時(shí)菌落已全部致死，故選擇0.78 g/L的6-MP為最低致死濃度。

表1 不同質(zhì)量濃度6-MP對腺苷產(chǎn)生菌生長影響的情況1)Table 1 Effects of different concentrations of 6-MP on the growth of adenosine producing bacteria

注：1)+++表示多，++表示一般，+表示稀少，-表示無；***表示大，**表示中等，*表示小，空白處表示平板上無菌落生長，因此對單菌落大小不作描述。

2.2 ARTP誘變篩選

2.2.1 ARTP誘變致死率及正突變率

ARTP誘變致死情況如表2所示，該腺苷產(chǎn)生菌對ARTP比較敏感。誘變60 s時(shí)致死率已達(dá)到83%，當(dāng)誘變時(shí)間為90 s時(shí)已完全致死。

統(tǒng)計(jì)誘變后在6-MP質(zhì)量濃度為0.78 g/L的抗性平板上長出的菌株，結(jié)合對照組菌落數(shù)，得出誘變時(shí)間和正突變率的關(guān)系，由表2可知短時(shí)間的ARTP處理并不能得到較高的致死率和正突變率，誘變60 s時(shí)正突變率達(dá)16%，60 s后致死率持續(xù)增大但正突變率則大幅減少。

表2 ARTP誘變時(shí)間與致死率和正突變率的關(guān)系

表3 ARTP誘變菌株的腺苷產(chǎn)量Table 3 Adenosine yield of ARTP-mutated strain

2.2.2 ARTP誘變菌株的發(fā)酵篩選

多次誘變挑取誘變后的正突變菌株37 ℃，240 r/min發(fā)酵3 d后測其腺苷產(chǎn)量，得到10株比出發(fā)菌株BS-0產(chǎn)量高的菌株，高產(chǎn)菌株編號(hào)和產(chǎn)量如表3所示。其中第1輪誘變得到5株高產(chǎn)菌株A-1，A-3，A-7，A-13和A-33，第2輪得到5株高產(chǎn)菌株A-2-4，A-2-12，A-2-17，A-2-18和A-2-20。其中ARTP第1輪誘變的A-7和第2輪誘變的A-2-12較出發(fā)菌株腺苷產(chǎn)量有明顯提高，A-2-12產(chǎn)量達(dá)19.297 g/L。

2.3 紫外誘變

2.3.1 紫外誘變致死率和正突變率

紫外誘變中加入助誘變劑LiCl誘變效果更好，以ARTP誘變的高產(chǎn)菌株A-2-12為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，在固體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的LiCl，致死率和正突變率如表4所示。0～160 s內(nèi)致死率較低，且無正突變菌株產(chǎn)生。正突變率出現(xiàn)在誘變200 s和240 s時(shí)，其中誘變時(shí)間為240 s的正突變率高達(dá)18.52%，其誘變致死率達(dá)83%。

表4 紫外誘變致死率和正突變率Table 4 Fatality rate and positive mutation rate of UV mutagenesis

2.3.2 紫外誘變菌株的發(fā)酵篩選

經(jīng)紫外和助誘變劑LiCl處理得到57株正突變株，編號(hào)為Z-L-1至Z-L-57，對正突變株進(jìn)行發(fā)酵得到10株產(chǎn)量比出發(fā)菌株A-2-12產(chǎn)量高的菌株，產(chǎn)量如表5所示，其中Z-L-5和Z-L-19產(chǎn)量均高于19.880 g/L。

表5 紫外誘變菌株的腺苷產(chǎn)量Table 5 Adenosine yield of UV-mutated strain

2.4 ARTP復(fù)合紫外誘變

將Z-L-5和Z-L-19菌株混合接種命名為Z-L-H，以Z-L-H為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP和紫外復(fù)合誘變。查L9(34)設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)來提高正突變，正交因素水平如表6所示，依據(jù)表6的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)而得到表7的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表6 復(fù)合誘變正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 6 Design of compound mutagenesis orthogonal experiment

表7 復(fù)合誘變正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)Table 7 Results of compound mutagenesis orthogonal experiment

續(xù)表7

注：1) 表中空白處表示非因素列，不作正交分析。

由表7可知，對正突變影響的大小順序是ARTP誘變>紫外誘變>LiCl濃度，最佳處理?xiàng)l件選擇ARTP誘變60 s低溫處理2 h，經(jīng)4 h培養(yǎng)后紫外誘變240 s稀釋涂布于LiCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的平板和抗性平板中。對復(fù)合誘變抗性平板上的46個(gè)單菌落編號(hào)，依次為A-Z-L-1至A-Z-L-46，產(chǎn)量如表8所示，得到8株高產(chǎn)菌株，其中A-Z-L-2產(chǎn)量達(dá)20.560 g/L。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對誘變篩選后的5株高產(chǎn)量菌株A-2-12，Z-L-5，Z-L-19，A-Z-L-2和A-Z-L-15進(jìn)行種子活化和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測其腺苷產(chǎn)量，傳代考察其穩(wěn)定性，穩(wěn)定性情況如表9所示。

表8 復(fù)合誘變菌株腺苷產(chǎn)量Table 8 Adenosine yield of the complex mutagenesis strain

表9 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 9 Stability test

由表9可知，傳代中5株菌株產(chǎn)量均低于第1代的腺苷產(chǎn)量，隨著傳代次數(shù)的增加各菌株產(chǎn)量下降幅度不等，只有A-Z-L-2產(chǎn)量相對穩(wěn)定，傳代6次后產(chǎn)量依然能達(dá)到20.512 g/L，因此如何提高菌種的穩(wěn)定性還有待研究。

3 結(jié) 論

通過對腺苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌進(jìn)行ARTP誘變，UV-LiCl以及組合誘變并結(jié)合腺苷合成前體次黃嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物6-MP抗性理性篩選，獲得了1株腺苷高產(chǎn)菌株A-Z-L-2，傳代6次后其腺苷產(chǎn)量達(dá)到20.512 g/L，較出發(fā)菌株腺苷產(chǎn)量提高了16.12%，該菌株具有較好的傳代穩(wěn)定性。目前腺苷高產(chǎn)菌株大多是經(jīng)過化學(xué)或者物理誘變所得，用一般的誘變劑進(jìn)一步處理時(shí)很難再篩選出更高產(chǎn)量的菌株，不但較難發(fā)生正突變，而且菌種極易發(fā)生退化。其主要原因是菌株的遺傳標(biāo)記不能穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)條件或保種條件不當(dāng)易造成菌種回復(fù)突變，從而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。有研究表明選育黃嘌呤或鳥嘌呤缺陷型有利于降低回復(fù)突變率[16]，通過增加遺傳標(biāo)簽提高遺傳穩(wěn)定性是腺苷發(fā)酵的一個(gè)研究方向。研究者可以利用新的誘變手段，提高誘變效率，也可以通過分子手段[17-18]改善腺苷產(chǎn)生菌。