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非達(dá)霉素(fidaxomicin)是一種新型窄譜的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，能有效控制艱難梭狀芽孢桿菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)[1-4]。非達(dá)霉素通過與RNA聚合酶結(jié)合抑制細(xì)菌繁殖，進(jìn)而針對(duì)性抑制艱難梭狀芽孢桿菌，其治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)藥物萬(wàn)古霉素和甲硝唑，并且具有更高的治愈率及更低的復(fù)發(fā)率[5-8]。目前，非達(dá)霉素主要通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)，相關(guān)研究主要集中在菌種改良、發(fā)酵條件及提取工藝優(yōu)化方面，鮮有種子培養(yǎng)工藝方面的研究報(bào)道，而種子的制備是微生物發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序，因此，提供生產(chǎn)性能穩(wěn)定且優(yōu)良的種子液非常重要?，F(xiàn)有報(bào)道的種子配方中大多含有牛肉膏和蛋白胨等動(dòng)物性原料[9-13]，由于動(dòng)物性原料存在潛在的病毒污染、成分不明確及不利于產(chǎn)物分離純化等缺點(diǎn)，F(xiàn)DA對(duì)動(dòng)物性原料要求非?？量蹋枰瞎?yīng)商通過CEP認(rèn)證或出BSE/TSE聲明，而多數(shù)廠家都不具備這一資質(zhì)，因此，在生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量避免使用動(dòng)物性原料，保障產(chǎn)品安全性。為了提高發(fā)酵產(chǎn)量及穩(wěn)定性，同時(shí)，替代種子配方中的動(dòng)物性原料，進(jìn)一步提升產(chǎn)品質(zhì)量及安全性，筆者對(duì)種子培養(yǎng)溫度、種子配方進(jìn)行優(yōu)化，確定種子最佳培養(yǎng)溫度，研究出無(wú)動(dòng)物性原料的種子配方，同時(shí)對(duì)種子培養(yǎng)工藝進(jìn)行細(xì)化，確定種齡及接種量，為發(fā)酵提供優(yōu)質(zhì)的種液，保證發(fā)酵穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

桔橙指孢囊菌(Dactylosporangiumaurantiacum)為本公司保藏菌種。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

固體培養(yǎng)基：葡萄糖4 g/L，酵母浸出粉4 g/L，麥芽浸粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖50 g/L，甘油10 g/L，酵母粉10 g/L，棉籽餅粉10 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，硫酸鎂2 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH 7.2。

1.2 培養(yǎng)條件

固體培養(yǎng)：將-80 ℃保藏的甘油管用無(wú)菌水稀釋涂布于平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7～9 d。刮取長(zhǎng)好的平板單菌落，制成菌懸液，取0.1 mL接入斜面培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)5～7 d。

種子培養(yǎng):將斜面菌體用無(wú)菌水制成菌懸液，接種于裝有20 mL(250 mL搖瓶)種子培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種液以10%接種量接入裝液量為20 mL(250 mL搖瓶)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)7～10 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)溫度

為了確定種子的最佳培養(yǎng)溫度，將新鮮斜面接入種子培養(yǎng)基中，分別放置在溫度為24，26，28，30，32 ℃的搖床間進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測(cè)種子液菌體生物量及發(fā)酵液非達(dá)霉素含量。

1.3.2 碳源的篩選

為了探究菌種對(duì)不同碳源的利用情況，考察了玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糊精和甘油等幾種常見碳源對(duì)種子生長(zhǎng)及發(fā)酵水平的影響。

1.3.3 動(dòng)物性氮源替代實(shí)驗(yàn)

選用植物來(lái)源的蛋白胨及微生物來(lái)源的蛋白胨代替初始的動(dòng)物性蛋白胨，在完成蛋白胨替代實(shí)驗(yàn)后，用玉米蛋白粉、棉籽精粉、多肽粉、麥芽浸粉和黃豆粉等幾種常用的氮源進(jìn)行牛肉膏替代實(shí)驗(yàn)，考查這幾種氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵水平的影響。

1.3.4 一級(jí)種子生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取生長(zhǎng)良好的新鮮斜面，接種于種子培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)24，32，40，48，56，64，72 h，測(cè)定菌體生物量、pH和總糖等指標(biāo)，通過顯微鏡鏡檢觀察菌絲形態(tài)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，生物量、總糖和pH等為縱坐標(biāo)，繪制一級(jí)種子生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 一級(jí)種子種齡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)一級(jí)種子生長(zhǎng)曲線，選取56，60，64，68，72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將對(duì)應(yīng)的種子以10%的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察種齡對(duì)發(fā)酵的影響，以發(fā)酵液中非達(dá)霉素含量來(lái)確定一級(jí)種子的最佳種齡。

1.3.6 二級(jí)種子種齡實(shí)驗(yàn)

為滿足產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)需求，進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)工藝研究。將培養(yǎng)56，64 h的一級(jí)種子液接入二級(jí)種子培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)32，40，48，56 h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，檢測(cè)發(fā)酵液中非達(dá)霉素含量，確定最佳二級(jí)種子移種時(shí)間。

1.3.7 二級(jí)種子種量實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)56 h的一級(jí)種子液按體積分?jǐn)?shù)分別為0.05%，0.1%，0.15%，0.2%接入二級(jí)種瓶，二級(jí)種子培養(yǎng)48 h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，檢測(cè)發(fā)酵液中非達(dá)霉素含量，確定最佳接種量。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 菌體生物量測(cè)定

菌體生物量采用菌體離心濃度(PMV)表示：取10 mL發(fā)酵液置于帶刻度離心管中，3 500 r/min離心10 min，測(cè)定離心后菌體體積。

1.4.2 總糖含量測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測(cè)定總糖含量[14]。

1.4.3 非達(dá)霉素產(chǎn)量測(cè)定

取發(fā)酵液1 mL加入甲醇3 mL，混合均勻密封。超聲處理30 min，吸取1 mL于12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 (m的有機(jī)濾膜過濾后，HPLC檢測(cè)非達(dá)霉素含量。

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C8柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(體積分?jǐn)?shù)為0.5%的乙酸水溶液)=58∶42；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 種子培養(yǎng)溫度

溫度是影響微生物生長(zhǎng)代謝的重要因素，通常培養(yǎng)溫度偏低，菌體生長(zhǎng)緩慢，菌體量偏少，影響發(fā)酵產(chǎn)量；培養(yǎng)溫度偏高，菌體代謝活動(dòng)加快，可以縮短培養(yǎng)時(shí)間，但菌體容易老化，影響發(fā)酵產(chǎn)量[15]。因此，為了獲得優(yōu)質(zhì)種子液，需要確定菌種的最佳培養(yǎng)溫度。溫度對(duì)種子生物量及發(fā)酵效價(jià)的影響見圖1。由圖1可知：種子在24，26 ℃培養(yǎng)時(shí)，菌體生物量較低，生長(zhǎng)緩慢，而在28～32 ℃培養(yǎng)時(shí)，菌體生物量較高。把不同溫度下培養(yǎng)的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測(cè)發(fā)酵液中非達(dá)霉素含量。結(jié)果表明:在30 ℃下培養(yǎng)的種子具有較高的活性，發(fā)酵產(chǎn)量較高，因此，確定種子的最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。

圖1 溫度對(duì)種子生物量及發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.1 The effect of temperature on seedbiomass and fermentation titer

2.2 種子碳源篩選

碳源既是構(gòu)成菌體細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的主要元素，又是提供微生物生命活動(dòng)所需能源的原料[16]。微生物的生理特性不同，對(duì)碳源的利用情況亦不相同。為探究種子對(duì)碳源的利用情況，實(shí)驗(yàn)考察了玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘油等幾種常見碳源對(duì)種子生長(zhǎng)及發(fā)酵水平的影響。對(duì)種液進(jìn)行生物量檢測(cè)和鏡檢，結(jié)果表明：可溶性淀粉、玉米淀粉和麥芽糊精為碳源時(shí)，菌體生物量較高，鏡檢時(shí)菌絲較粗壯，染色較深。種子碳源對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響見圖2。由圖2可知：以可溶性淀粉和玉米淀粉為碳源時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)非達(dá)霉素效價(jià)較高；以葡萄糖和甘油為碳源時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)非達(dá)霉素效價(jià)較低。綜合發(fā)酵水平、菌體生物量及鏡檢結(jié)果，最終選擇玉米淀粉作為種子碳源。

1—可溶性淀粉；2—玉米淀粉；3—葡萄糖；4—蔗糖；5—麥芽糊精；6—甘油圖2 種子碳源對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.2 The effect of seed carbon sourceon fermentation titer

2.3 動(dòng)物性氮源替代實(shí)驗(yàn)

氮源主要是構(gòu)成微生物細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等)和含氮代謝產(chǎn)物[16]。初始種子配方中含有牛肉膏和蛋白胨兩種動(dòng)物性氮源，為了提高產(chǎn)品質(zhì)量及安全性，實(shí)驗(yàn)采用幾種常用氮源分別替代這兩種動(dòng)物性氮源，考查菌種對(duì)氮源的利用情況及其對(duì)發(fā)酵水平的影響。

2.3.1 蛋白胨替代實(shí)驗(yàn)

首先用植物來(lái)源的大豆蛋白胨及微生物來(lái)源的酵母蛋白胨FP101，F(xiàn)P102和FP103替代原始的動(dòng)物性蛋白胨。通過生物量檢測(cè)及鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)3種型號(hào)的酵母蛋白胨均優(yōu)于大豆蛋白胨。不同來(lái)源的蛋白胨對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響見圖3。由圖3可知：酵母蛋白胨FP102與蛋白胨在發(fā)酵水平上無(wú)差異，因此可用酵母蛋白胨FP102替代初始的動(dòng)物性蛋白胨。

1—蛋白胨；2—大豆蛋白胨；3—FP101；4—FP102；5—FP103圖3 不同來(lái)源的蛋白胨對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.3 The effects of peptone from different sourceson fermentation titer

2.3.2 牛肉膏替代實(shí)驗(yàn)

酵母蛋白胨FP102成功替代動(dòng)物性蛋白胨后，選用玉米蛋白粉、棉籽精粉、多肽粉、麥芽浸粉和黃豆粉等幾種常用氮源替代牛肉膏實(shí)驗(yàn)。不同氮源代替牛肉膏對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響見圖4。由圖可知：多肽粉替代牛肉膏時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)非達(dá)霉素水平優(yōu)于牛肉膏，綜合生物量及鏡檢結(jié)果，最終以多肽粉替代牛肉膏。

1—牛肉膏；2—玉米蛋白粉；3—棉籽精粉；4—多肽粉；5—麥芽浸粉；6—黃豆粉圖4 不同氮源代替牛肉膏對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.4 The effect of different nitrogen sources insteadof beef extract on fermentation titer

完成種子碳源篩選及動(dòng)物性氮源替代實(shí)驗(yàn)后，確定新的種子配方為：玉米淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，多肽粉3 g/L，酵母蛋白胨FP102 5 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH 7.0。以初始培養(yǎng)基為對(duì)照分別測(cè)定優(yōu)化前后菌體生物量及接入發(fā)酵培養(yǎng)基后測(cè)定發(fā)酵水平。結(jié)果表明：進(jìn)行種子配方優(yōu)化及動(dòng)物性原料替代后，種子液生物量及發(fā)酵產(chǎn)非達(dá)霉素水平均有所提高，同時(shí)提高了原料安全性及產(chǎn)品質(zhì)量。

2.4 一級(jí)種子培養(yǎng)條件

2.4.1 一級(jí)種子生長(zhǎng)曲線

一級(jí)種子生長(zhǎng)曲線見圖5。由圖5可知：種子培養(yǎng)過程中，0～32 h為延滯期，菌體生長(zhǎng)緩慢，pH下降，總糖消耗較慢；32～64 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體快速生長(zhǎng)，菌體生物量快速增加，總糖消耗較快，pH由7.23快速上升至7.92；64 h后為穩(wěn)定期，總糖消耗放緩，生物量及pH維持穩(wěn)定。一般情況下，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期的種子活性較強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖速度快，因此，選擇56～64 h為較合適的一級(jí)種齡范圍。

圖5 一級(jí)種子生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curve of primary seed

2.4.2 一級(jí)種齡對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵的影響

在菌體生長(zhǎng)過程中，不同生長(zhǎng)階段的菌體生理活性差別較大，因此，接種種齡的控制非常重要。根據(jù)一級(jí)種子生長(zhǎng)曲線，將種子分別培養(yǎng)56，58，60，62，64 h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。種齡對(duì)生物量及發(fā)酵效價(jià)的影響見圖6。由圖6可知：種齡為56 h時(shí)，生物量較低，發(fā)酵液效價(jià)較低，種齡為62，64 h時(shí)，生物量和發(fā)酵效價(jià)均較高。為了便于人員和設(shè)備的合理安排及生產(chǎn)活動(dòng)的操作便利性，確定一級(jí)種子的培養(yǎng)時(shí)間為64 h。

圖6 種齡對(duì)生物量及發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.6 The effect of seed age on biomass and fermentation titer

2.5 二級(jí)種子培養(yǎng)條件

在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，發(fā)酵罐的體積越大，所需的種子也越多，因此，需要對(duì)種子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)可以為發(fā)酵生產(chǎn)提供優(yōu)良的種子液，保證發(fā)酵穩(wěn)定性并提高發(fā)酵產(chǎn)量。因此，二級(jí)種子工藝研究對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)意義重大。

2.5.1 二級(jí)種子種齡實(shí)驗(yàn)

工業(yè)化生產(chǎn)中，一級(jí)和二級(jí)種子的種齡對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)水平影響很大。種齡過于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，前期生長(zhǎng)緩慢，菌體生物量低，發(fā)酵周期延長(zhǎng)；種齡過老的種子接入發(fā)酵罐后，菌種活性較低導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退；代謝旺盛且成熟的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌體能快速適應(yīng)新的發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境，大大縮短延滯期及發(fā)酵產(chǎn)物合成周期，提高生產(chǎn)水平及生產(chǎn)效率[17]。不同的種子培養(yǎng)時(shí)間直接影響種子活力，進(jìn)而影響發(fā)酵產(chǎn)抗能力。

實(shí)驗(yàn)選取生長(zhǎng)56，64 h的一級(jí)種子分別接種至二級(jí)種子液中，培養(yǎng)不同時(shí)間后測(cè)定生物量及非達(dá)霉素含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明：種齡56 h的一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至二級(jí)種子液，培養(yǎng)48 h后，種子生物量及發(fā)酵產(chǎn)非達(dá)霉素水平均較高，因此確定生產(chǎn)工藝為一級(jí)種子培養(yǎng)56 h，二級(jí)種子培養(yǎng)48 h。通過培養(yǎng)基及種子工藝優(yōu)化，非達(dá)霉素產(chǎn)量較原工藝提高了12.3%。

表1 種齡對(duì)生物量及發(fā)酵效價(jià)的影響Table 1 The effect of seed age on biomass and fermentation titer

2.5.2 二級(jí)種子種量實(shí)驗(yàn)

接種量大小直接影響菌體生長(zhǎng)繁殖的速度，進(jìn)而影響發(fā)酵水平[18]。中試放大時(shí)，如果一級(jí)種子到二級(jí)種子的接種量過大，則備種壓力較大，同時(shí)會(huì)增加染菌概率；而接種量過小，則會(huì)延長(zhǎng)種子培養(yǎng)時(shí)間，菌量過低，影響發(fā)酵水平。一般而言，二級(jí)種子的接種量應(yīng)控制在0.2%以下，以便于放大生產(chǎn)。

在確定種子配方及接種工藝的基礎(chǔ)上，進(jìn)行二級(jí)種子接種量實(shí)驗(yàn)。接種量對(duì)生物量及發(fā)酵效價(jià)的影響見圖7。由圖7可知：二級(jí)種子接種量為0.05%時(shí)，種子菌量較低，發(fā)酵產(chǎn)非達(dá)霉素水平較低。當(dāng)二級(jí)種子接種量在0.1%～0.2%之間時(shí)，菌體量及發(fā)酵水平均無(wú)明顯差異，因此選擇0.1%～0.2%作為二級(jí)種子接種量。

圖7 接種量對(duì)生物量及發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.7 The effect of inoculum size onbiomass and fermentation titer

3 結(jié) 論

優(yōu)質(zhì)且穩(wěn)定的種液是微生物發(fā)酵制藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，在選育優(yōu)良菌種的同時(shí)，需要對(duì)種子的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組成和種齡種量進(jìn)行優(yōu)化，以提高種液的穩(wěn)定性及生產(chǎn)能力。用酵母蛋白胨FP102替代了原種子配方中的牛肉膏和蛋白胨兩種動(dòng)物性原料，優(yōu)化了種子培養(yǎng)溫度及種子配方中的碳源和氮源，確定種子最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃，研究出無(wú)動(dòng)物性原料的新種子配方：玉米淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，多肽粉3 g/L，酵母蛋白胨FP102 5 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH 7.0。確定一級(jí)種子培養(yǎng)條件為30 ℃培養(yǎng)64 h；確定一級(jí)種子培養(yǎng)56 h，按0.1%～0.2%的接種量轉(zhuǎn)接二級(jí)種子，培養(yǎng)48h后二級(jí)種子可達(dá)較佳的生理狀態(tài)，具有較高的生產(chǎn)能力。研究成功替代原配方的動(dòng)物性原料，避免潛在的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)，提升產(chǎn)品安全性及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并通過優(yōu)化培養(yǎng)基及種子工藝研究，使非達(dá)霉素產(chǎn)量提高了12.3%，為提高發(fā)酵產(chǎn)量及發(fā)酵穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)。