程邊媛，陶 峰，郭子湖，陳紅波

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院，安徽 合肥 230001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院生物信息學(xué)中心系統(tǒng)藥理學(xué)實驗室，陜西 咸陽 712100）

原發(fā)性痛經(jīng)是最常見的婦科疾病，以月經(jīng)前后出現(xiàn)不規(guī)則下腹痛或痙攣為特征，不伴盆腔器質(zhì)性病變，嚴(yán)重者有惡心、嘔吐、腹瀉等伴隨癥狀，嚴(yán)重影響現(xiàn)代女性的學(xué)習(xí)和生活［1］。原發(fā)性痛經(jīng)的病理機制尚不完全清楚，目前認(rèn)為前列腺素的異常增加是重要的致病因素，導(dǎo)致子宮異常收縮，減少子宮血流量，引起周圍神經(jīng)的敏感性從而引起疼痛［2］。非甾體抗炎藥（NSAID）是治療原發(fā)性痛經(jīng)的一線藥物，主要通過抑制環(huán)氧酶，減少前列腺素的合成，達(dá)到抗炎止痛的目的，但長期服用會產(chǎn)生胃腸道等不良反應(yīng)［3］。中藥香附具有解郁引氣、調(diào)經(jīng)止痛的功效，對原發(fā)性痛經(jīng)治療效果顯著，副作用少，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)香附有抑制平滑肌收縮、阻止痛覺信號傳導(dǎo)和雌激素樣作用［4］。由于香附所含成分復(fù)雜，作用機制繁多，探究其治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用機制成為藥理學(xué)研究的難點。隨著信息化的發(fā)展，系統(tǒng)藥理學(xué)作為一門新學(xué)科逐漸興起，通過整合計算機技術(shù)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等多門學(xué)科，已初步應(yīng)用于中藥復(fù)方作用機制的研究中，如合理地解釋了犀角地黃湯、藏紅花復(fù)方治療病毒性出血熱和心血管疾病的作用機制［5-6］。本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)方法探索香附在原發(fā)性痛經(jīng)治療中的藥效物質(zhì)和作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 利用分析軟件和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行系統(tǒng)藥理實驗研究，主要包括系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php） 、Uniprot 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.uniprot.org） 、DAVID 數(shù) 據(jù) 庫（http：//david.abcc.ncifcrf.gov）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路數(shù)據(jù)庫（http//www.kegg.jp/）、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、藥物—靶點相互作用（Chemistry-Genomics-Pharmacology Integration，CGPI） 模型、WES 模型、Cytoscape3.3.0 軟件、Visio繪圖軟件。

1.2 篩選香附的活性成分和作用靶點

1.2.1 藥物分子篩選 結(jié)合文獻(xiàn)報道和系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）來收集香附含有的所有成分，通過藥物動力學(xué)ADME相關(guān)參數(shù)如口服生物利用度（OB）、Caco-2透過性、血腦屏障（BBB）和類藥性（DL）篩選出候選的活性分子［7］。根據(jù)TCMSP建議的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：OB≥30%、Caco-2＞0、BBB＞-0.3、DL≥0.18；同時從中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫搜索與香附成分相關(guān)的研究文獻(xiàn)，對入選的成分進(jìn)行補充完善。

1.2.2 藥物靶點篩選 藥物識別過程是探索新藥作用機制的重要過程，利用藥物—靶點相互作用模型即CGPI模型和WES模型預(yù)測藥物靶點［8-9］。隨后，將預(yù)測的靶點映射到Uniprot數(shù)據(jù)庫識別生物來源，限定與人類相關(guān)的靶點，同時校正基因名為官方標(biāo)準(zhǔn)名稱［10］。最后，通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析（Gene Ontology enrichment analysis），篩選出與原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)的靶點基因［11-12］。

1.3 構(gòu)建活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò) Cytoscape3.3.0軟件是一個公開的生物網(wǎng)絡(luò)資源［13］，根據(jù)藥物分子和靶點的對應(yīng)關(guān)系可構(gòu)建分子—靶點網(wǎng)絡(luò)圖，利用插件Network Analyzer分析分子—靶點網(wǎng)絡(luò)特征［14］，其中“節(jié)點”表示分子和靶點，“邊”表示藥物分子和靶點的相互作用。此外，作為重要的定量參數(shù)“度”用于評估節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，度的大小表示與節(jié)點相連的靶點的數(shù)量（見表1）。

1.4 構(gòu)建生物通路，分析作用機制 將所有篩選的靶點映射進(jìn)KEGG數(shù)據(jù)庫，篩選出與原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)的通路，利用Visio繪圖軟件繪制出整合的原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)通路，闡釋中藥復(fù)方治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用機制。

2 結(jié)果

2.1 香附活性成分篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、文獻(xiàn)收集、ADME性質(zhì)共篩選出14種活性成分（見表1）。雖然有些活性成分不完全符合ADME篩選條件，但是根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道仍保留下來作為活性分子，例如編號為MOL13的活性成分α-香附酮（αcyperone），其類藥性為 0.10，但溫東婷等［15］證明 α-香附酮能抑制大鼠離體子宮自發(fā)性收縮，同時也可抑制由縮宮素引起的離體子宮的收縮，并呈劑量依賴關(guān)系，是香附中重要的活性成分。

2.2 香附靶點篩選結(jié)果與分析 通過CGPI模型和WES模型預(yù)測藥物靶點、Uniprot數(shù)據(jù)庫、DAVID數(shù)據(jù)庫篩選出活性成分作用的靶點蛋白，最終得到83種靶點蛋白。根據(jù)與原發(fā)性痛經(jīng)的相關(guān)性對靶點蛋白進(jìn)行基因本體即GO分析，使用P-value＜0.05對靶點蛋白進(jìn)行功能富集分析（見圖1），其中血管生成的調(diào)節(jié)過程、炎癥反應(yīng)、一氧化氮合成過程顯著性較高。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了更好地了解不同的藥物分子和靶點間的相互作用關(guān)系，將活性分子與作用靶點映射到Cytoscape軟件中，得到藥物活性分子—靶點網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點數(shù)97個，藥物分子與靶點的相互作用關(guān)系187條（見圖2），多數(shù)活性分子不只與單一靶點結(jié)合，而某些靶點也同時與多個活性分子連接，體現(xiàn)中藥多分子、多靶點的特征。在網(wǎng)絡(luò)中高度連接的活性分子和靶點蛋白如下：槲皮素、木樨草素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇，在網(wǎng)絡(luò)中度的大小分別為66、32、27、16、10，靶點蛋白 ESR1、PTGS2、PPARG 的度分別是13、10、8；這些度較高的分子和靶點可能在香附的作用機制中起關(guān)鍵作用。

表1 香附活性成分篩選結(jié)果

圖1 GO富集分析

圖2 香附活性分子—靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 香附治療原發(fā)性痛經(jīng)的信號通路

2.4 生物通路分析 在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得的與原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)的通路有24條，其中大部分靶點蛋白集中在分布在VEGF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路，關(guān)系到血管新生過程、低氧下細(xì)胞應(yīng)激、炎癥因子的表達(dá)，利用Visio繪圖軟件整合出與原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)的信號通路，見圖3。不會增加PGF2α的合成，從而減少子宮的異常收縮。此外，在活性分子—靶點網(wǎng)絡(luò)中木犀草素（MOL01，luteolin）等10種活性分子同時調(diào)節(jié)PTGS2的表達(dá)，國內(nèi)已有實驗發(fā)現(xiàn)木犀草素可以抑制PTGS2的表達(dá)，而PTGS2是花生四烯酸代謝途徑生成前列素類物質(zhì)的關(guān)鍵合成酶，其表達(dá)受到抑制會減少前列腺素E2的釋放［17］。網(wǎng)絡(luò)分析表明，香附的有效成分通過協(xié)同作用增強或抑制靶點蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮藥效作用。

本研究通過GO分析發(fā)現(xiàn)，靶點蛋白參與的生物過程多數(shù)與原發(fā)性痛經(jīng)的病理機制相關(guān)，利用KEGG數(shù)據(jù)庫整合出靶點蛋白參與的生物通路，這些信號通路主要集中于花生四烯酸代謝、血管相關(guān)因子和炎癥因子表達(dá)等過程。VEGF信號通路中VEGF、VEGFR2、COX2靶點蛋白通過Ca2+磷脂依賴性激酶途徑調(diào)節(jié)PGI2的生成過程，PGI2具有強大的抗凝作用，可以抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集和釋放，防止血小板局部聚集形成血栓［18］；HIF-1信號通路是細(xì)胞低氧應(yīng)激下的重要信號通路，HIF-1α?xí)龠M(jìn)VEGF等血管生長因子的表達(dá)，有利于組織缺血后的恢復(fù)［19］，iNOS、eNOS等靶點蛋白參與血管調(diào)節(jié)因子一氧化氮（NO）的合成過程，NO是一種具有多種生物功能的分子，不僅可以舒張血管，調(diào)節(jié)外周的痛覺敏感性，而且參與調(diào)節(jié)子宮的收縮性［2，20］；Toll樣受體信號通路中出現(xiàn)了TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥相關(guān)因子，這些炎癥因子在

3 討 論

目前治療原發(fā)性痛經(jīng)的藥物主要是作用于生成前列腺素的花生四烯酸途徑，然而該病與激素水平（前列腺素和雌、孕激素）、血管舒縮因子（一氧化氮、內(nèi)皮素）、氧化應(yīng)激因子（超氧化物歧化酶、丙二醛）等多種因素相關(guān)［15］，致病因素復(fù)雜多樣，影響到不同的作用靶點和信號通路。中藥香附成分復(fù)雜，作用廣泛，可能與多個靶點和通路相聯(lián)系，常作為中藥復(fù)方中治療原發(fā)性痛經(jīng)的重要組成藥物，如香附四物湯、艾附暖宮丸等，療效顯著。系統(tǒng)藥理學(xué)從整體角度出發(fā)，綜合分析藥物活性成分、靶點及作用通路的關(guān)系，適用于中藥多分子、多靶點的作用評估。本研究利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法篩選出香附的14種活性成分和83個可能的作用靶點，通過構(gòu)建分子—靶點網(wǎng)絡(luò)圖直觀地呈現(xiàn)了187條相互作用關(guān)系。在活性分子—靶點網(wǎng)絡(luò)中 ，β - 谷 甾 醇 （MOL04，beta-sitosterol）、 豆 甾 醇（MOL07，Stigmasterol） 等都同時調(diào)節(jié)雌激素受體ESR1。β-谷甾醇、豆甾醇都屬于植物甾醇類化合物，是天然的雌激素受體激動劑，可以作為雌激素受體激動劑的替代品［16］。相關(guān)研究報道雌激素含量增加會間接促進(jìn)PGF2α的合成和釋放，導(dǎo)致子宮收縮、血供不足引起痛經(jīng)［2］。由此推測，香附活性分子可能與體內(nèi)的雌激素競爭相應(yīng)受體，產(chǎn)生類雌激素作用，但是痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜的濃度偏高，與痛經(jīng)的發(fā)生緊密相關(guān)［21］；NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在整合的通路中調(diào)節(jié)上述炎癥因子的表達(dá)，而相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)在低氧狀態(tài)下NF-κB可能調(diào)節(jié)炎癥因子IL-6的基因表達(dá)，在IL-6的轉(zhuǎn)錄過程中占有重要地位［22］，該發(fā)現(xiàn)從側(cè)面證實了整合的信號通路的合理性。因此推測香附治療原發(fā)性痛經(jīng)不僅抑制花生四烯酸途徑，而且調(diào)節(jié)其他與原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)的病理過程，如血小板的聚集、血管相關(guān)因子（VEGF、iNOS等）、炎癥因子（白細(xì)胞介素、TNF-α等）的表達(dá)，從而抑制血栓形成，促進(jìn)組織修復(fù)，調(diào)節(jié)子宮的收縮性，達(dá)到緩解痛經(jīng)的目的。

綜上所述，香附治療原發(fā)性痛經(jīng)具有多分子、多靶點、多通路的特點，相關(guān)的通路存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制，體現(xiàn)中醫(yī)藥治療復(fù)雜疾病的優(yōu)勢。系統(tǒng)藥理學(xué)方法可引導(dǎo)人們從新的角度審視原發(fā)性痛經(jīng)的致病因素，研制出更有效的治療原發(fā)性痛經(jīng)的藥物。