韋江蓮，陳雪麗，蘭 嵐，韋 穩(wěn)，蒙 娜，黃盛凱，黃彥峰

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

蕨類(lèi)植物資源豐富，民間用藥歷史悠久。腎蕨系骨碎補(bǔ)科腎蕨屬植物 Nephrolepi scordifolia（L.）Presl，別名馬騮卵、鳳凰蛋、石黃皮、圓羊齒等，是一種具有壯族特色的藥用植物［1］。腎蕨用藥部位為全株或塊莖，具有祛濕消腫、清熱解毒功效，臨床用于治療黃疸、淋濁、小便澀痛、痢疾、疝氣、乳癰、瘰疬、燙傷、刀傷等病癥［2］。民間常用腎蕨全株煎水治療濕熱黃疸，療效良好。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)腎蕨化學(xué)成分、提取工藝、藥理作用以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究已取得一定進(jìn)展［3-11］。為進(jìn)一步探究腎蕨對(duì)肝臟的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)采用酒精灌胃的方式造成小鼠急性酒精肝損傷模型，觀(guān)察腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷的影響并探討其可能的作用機(jī)制，為研究腎蕨的護(hù)肝作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK桂2017-0003。

1.2 儀器 TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；PRO200型勻漿機(jī)（PROScientific Inc Oxford CT，USA）；7600service日立自動(dòng)生化分析儀（日本日立集團(tuán)）；722 N可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 藥品及試劑 腎蕨采自百色市東坪水庫(kù)，經(jīng)鑒定為骨碎補(bǔ)科腎蕨屬植物 Nephrolepi scordifolia（L.）Presl；聯(lián)苯雙酯滴丸（北京協(xié)和藥廠(chǎng)，批號(hào)：15100102）；考馬斯亮藍(lán)試劑、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、總超氧化物歧化酶（SOD）試劑，均購(gòu)自南京建成生物研究所；56°牛欄山二鍋頭（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠(chǎng)）。

2 方法

2.1 腎蕨水提液的制備［3］將新鮮腎蕨全株烘干粉碎，稱(chēng)取粗粉10 g，置錐形瓶中，加入蒸餾水100 ml，冷浸24 h，取濾液濃縮至10 ml，即含生藥量1 g/ml，冷藏，用時(shí)恢復(fù)至室溫。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 取健康昆明種小鼠50只，雌雄各25只，隨機(jī)將小鼠分為5組：空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸組（0.10 g/kg）、腎蕨水提液低劑量組（3.25 g/kg）及腎蕨水提液高劑量組（6.50 g/kg）。每組10只。聯(lián)苯雙酯滴丸組和腎蕨水提液高、低劑量組分別按每天10ml/kg給藥，空白組和模型組每日給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥14d，最后一次給藥1h后除空白組給予等量的生理鹽水外，其余各組小鼠均按15 ml/kg給予56°牛欄山二鍋頭灌胃造模［12］，禁食不禁水 16h。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 血清ALT、AST的測(cè)定 造模16 h后稱(chēng)量小鼠體重，眼球取血，靜置2 h后，3 500 r/min離心10 min，取上層血清備用［11］。通過(guò)自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清 ALT、AST。

2.3.2 小鼠肝臟指數(shù)測(cè)定 將采血后的小鼠立即處死，同時(shí)迅速取出肝臟，并置入冰凍的0.9%氯化鈉溶液中清洗，濾紙吸干表面水分，觀(guān)察小鼠臟器外觀(guān)，稱(chēng)肝濕重，并計(jì)算肝臟指數(shù)，其中肝臟指數(shù)＝1000×［肝臟濕重/體重］×100%。

2.3.3 肝組織中MDA、GSH、SOD的測(cè)定 取小鼠同一部位肝臟左葉，按照1∶9的比例，放入冰凍的生理鹽水中，剪碎后勻漿，制備成10%肝組織勻漿。將10%肝組織勻漿置于離心機(jī)，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液留置備用。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行嚴(yán)格操作，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定小鼠肝組織蛋白質(zhì)濃度，測(cè)定肝組織MDA、GSH、SOD吸光度值，通過(guò)試劑盒所提供的公式計(jì)算肝組織中MDA、GSH、SOD的含量。

2.3.4 肝臟病理組織學(xué)檢查 另取小鼠右葉相同部位肝組織置于10%福爾馬林溶液中保存，組織切片，HE染色，在光鏡下觀(guān)察肝臟病理組織學(xué)變化以及圖片采集。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷肝指數(shù)的影響 見(jiàn)表1。

表1結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組肝指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸組及腎蕨水提液低、高劑量組肝指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。

表1 腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷肝指數(shù)的影響（x±s）

3.2 腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷血清ALT、AST的影響 見(jiàn)表2。

表2結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組血清ALT、AST 含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸組及腎蕨水提液低、高劑量組的ALT、AST含量均顯著降低（P＜0.01）。

3.3 腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷肝組織MDA、GSH、SOD的影響 見(jiàn)表3。

表3結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠肝組織中MDA含量顯著升高（P＜0.01），GSH水平和SOD活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸組及腎蕨水提液低、高劑量組MDA含量顯著降低（P＜0.01），SOD 活性及 GSH 水平顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。

表2 腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷血清ALT、AST的影響 （±s）

表2 腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷血清ALT、AST的影響 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg） ALT（U/L） AST（U/L）空白組 10 — 46.00±6.91 115.70±18.54模型組 10 — 118.70±11.14① 206.70±27.16①聯(lián)苯雙酯滴丸組 10 0.10 55.10±13.04② 25.30±15.70②腎蕨水提液低劑量組 10 3.25 63.00±9.13② 167.78±18.81②腎蕨水提液高劑量組 10 6.50 57.90±11.16② 150.60±18.68②

表3 腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷肝組織MDA、GSH、SOD的影響 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg） MDA（nmol/ml） GSH（U/ml） SOD（U/ml）空白組 10 — 7.28±1.98 25.01±2.77 228.53±21.99模型組 10 — 24.09±3.55② 19.69±2.35① 206.52±27.69①聯(lián)苯雙酯滴丸組 10 0.10 12.54±3.73④ 23.33±2.22④ 228.62±29.03③腎蕨水提液低劑量組 10 3.25 15.27±4.07④ 22.65±2.36③ 235.79±20.96④腎蕨水提液高劑量組 10 6.50 14.79±6.37④ 22.65±3.11③ 230.98±19.86③

3.4 腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷肝臟病理組織學(xué)的影響 肝組織常規(guī)HE染色鏡下可見(jiàn)：空白組小鼠肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)正常，輕微水腫，匯管區(qū)有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯病理變化；模型組小鼠肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)有顯著的病理變化，肝組織結(jié)構(gòu)彌漫性水腫，胞漿腫脹透亮、疏松，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞明顯溶解、壞死；聯(lián)苯雙酯滴丸組肝細(xì)胞組織有水腫，受炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有部分肝細(xì)胞再生表現(xiàn)；腎蕨水提液低劑量組肝細(xì)胞組織有水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有肝細(xì)胞再生表現(xiàn)；腎蕨水提液高劑量組肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)水腫減輕，極少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞再生表現(xiàn)明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織顯微結(jié)構(gòu)（HE，×200）

4 討論

過(guò)量飲用乙醇會(huì)導(dǎo)致肝組織損傷，通常認(rèn)為與抗氧化損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及免疫損傷等有關(guān)［13］。過(guò)量的乙醇在機(jī)體內(nèi)代謝可產(chǎn)生大量的自由基，致使抗氧化能力降低，導(dǎo)致肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。此外，機(jī)體的免疫功能與其免疫器官重量改變密切相關(guān)，在機(jī)體中，肝臟內(nèi)含有吞噬功能強(qiáng)大的免疫細(xì)胞，具有防御免疫能力［14］。由此，本研究將肝臟指數(shù)變化作為觀(guān)察指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，腎蕨水提液低、高劑量組肝指數(shù)均顯著降低，表明腎蕨水提液可降低急性酒精肝損傷小鼠的肝指數(shù)，對(duì)受損肝臟具有一定的保護(hù)作用。在正常的肝臟中，ALT、AST轉(zhuǎn)氨酶對(duì)于肝臟代謝極其重要，是反映肝功能的敏感指標(biāo)。當(dāng)肝組織損傷時(shí)，細(xì)胞的胞漿及線(xiàn)粒體分別將ALT、AST釋放入血中，造成ALT、AST在血清中的含量有不同程度的升高［15］。與模型組對(duì)比，腎蕨水提液低、高劑量組ALT、AST含量明顯降低，說(shuō)明腎蕨水提液能抑制急性酒精肝損傷小鼠的轉(zhuǎn)氨酶升高。MDA是肝細(xì)胞中發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，側(cè)面反映出肝細(xì)胞損傷的程度［16］。在正常的機(jī)體中存在著抗氧化酶和抗氧化劑，形成了重要的防御系統(tǒng)以對(duì)抗活性氧產(chǎn)生的損害。GSH是一種衡量機(jī)體抗氧化能力大小的低分子清除劑［16］。在機(jī)體受到外界因素影響時(shí)，SOD保護(hù)細(xì)胞避免受到破壞及清除超氧陰離子自由基，對(duì)維持機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起關(guān)鍵作用。與模型組對(duì)比，聯(lián)苯雙酯滴丸組及腎蕨水提液低、高劑量組MDA含量降低，SOD活性和GSH水平升高，說(shuō)明腎蕨水提液可以減少抗脂質(zhì)過(guò)氧化和提高抗氧化酶的活性，有效清除活性氧自由基，進(jìn)而對(duì)損傷的肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。此外，各組小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)彌漫性水腫，胞漿腫脹透亮、疏松，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞明顯溶解、壞死。而經(jīng)過(guò)腎蕨水提液干預(yù)后的小鼠，其肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)水腫減輕，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有肝細(xì)胞再生表現(xiàn)，表明對(duì)急性酒精肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，腎蕨水提液對(duì)小鼠急性酒精肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除超氧陰離子自由基、抑制肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)。由于腎蕨水提液所含成分較為復(fù)雜，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。