楊 鍇 閆有圣 譚 亞 任 茁 楊華昕 李 智 李 乾 藺 莉*

1.北京大學國際醫(yī)院 (102206)；2.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所

在全部自然妊娠的胚胎中，遺傳學異常的發(fā)生率約為5%～10%，以染色體非整倍體和片段性缺失或重復為主[1]。對早孕期稽留流產胚胎和中孕期因超聲異常而引產的胎兒進行遺傳學檢測，有助于明確其發(fā)生原因，進而指導再生育。傳統(tǒng)的遺傳學檢測包括染色體核型分析和熒光原位雜交(FISH)等方法[2-3]。近年來，染色體微陣列雜交、全基因組測序(WGS)等分子技術越來越多地作為一線檢測方法用于流產組織物的遺傳學分析[4-6]。本研究綜合使用熒光定量聚合酶鏈式反應(QF-PCR)和WGS技術對早、中孕期引產組織物進行序貫檢測，并使用FISH驗證QF-PCR檢測三倍體的結果。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究通過本院生物醫(yī)學倫理委員會審查批準。納入2015年10月—2018年5月在本院婦產科行稽留流產清宮術或中孕期引產的胚胎組織物樣本143例，其中早孕期稽留流產樣本131例 ，中孕期因胎兒超聲診斷異常引產樣本12例。

1.2 實驗室檢測

1.2.1QF-PCR檢測對全部樣本，使用Amp基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取胚胎組織和孕婦血液的DNA。利用QF-PCR方法(MicroreaderTM21 (Direct) ID System，北京閱微基因公司)檢測早孕期的131例樣本及其母源樣本，該試劑盒包含21組短串聯(lián)重復(STR)標記[6]。按照試劑盒操作說明書進行多重PCR擴增，然后按常規(guī)方法使用測序儀(Applied Biosystems 3500，Life公司，美國)進行毛細管電泳，并使用系統(tǒng)自帶軟件進行分析。對MCC陽性樣本直接終止檢測做出報告；對可疑為三倍體陽性的樣本使用FISH方法進行驗證，共選取7組熒光探針(GLP13、GLP21、GLP16、GLP22、CSP 18、CSPX、CSPY，北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)，按文獻[7]方法使用熒光分析系統(tǒng)(Imager. Z2，Zeiss公司，德國)進行采圖分析。

1.2.2WGS分析對排除母源細胞污染以及非三倍體的早孕期樣本，以及中孕期引產胎兒組織樣本(取大腿外側皮膚肌肉樣本，按上述方法提取DNA)，進行WGS檢測。按文獻[8]方法將DNA片段化、建文庫，再使用Illumina HiSeq 2500測序平臺進行測序，數(shù)據(jù)按常規(guī)方式進行生物信息學分析，參考美國醫(yī)學遺傳學協(xié)會指南[9]判別拷貝數(shù)變異(CNV)的致病性。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 20.0軟件，做如下統(tǒng)計學處理：①按照單次和復發(fā)性(兩次及以上)稽留流產對病例進行分組，比較兩組檢測結果陽性率的差異；②按有、無不良生活習慣(吸煙)和化學藥品/輻射暴露分組，比較兩組陽性檢出率差異。

2 結果

2.1 對象一般情況

131例早孕期稽留流產樣本的臨床資料：孕婦年齡32.8±4.6歲；孕周10.8±2.7；單次不良孕產史77例(53.8%)，多次不良孕產史54例(41.2%)；有不良生活習慣者(配偶吸煙)17例(13.0%)，化學藥品暴露史4例(3.0%)，輻射暴露史1例(0.8%)；檢測夫妻染色體核型的13例中異常2例，正常11例。12例中孕期引產樣本的臨床資料見表1。

表1 12例中孕期引產樣本的臨床資料

2.2 QF-PCR檢測結果

131例早孕期流產組織物樣本中，檢出3例為100%MCC，終止檢測并回報結果；3例為可疑三倍體陽性，經FISH驗證染色體核型為69,XXX(圖1)。

2.3 WGS檢測結果

WGS方法共檢測137例樣本(125例早孕期、12例中孕期)，檢出非整倍體43例(均為早孕期樣本)、CNV10例(9例早孕期樣本，1例中孕期樣本)，共53例(39%)。其中52例為早孕期稽留流產樣本，1例為中孕期引產樣本(表2)。在非整倍體異常中，22號三體(8例，18.6%)、16號三體(6例，13.9%)、21號三體(5例，11.6%)、13號三體(5例，11.6%)、X單體(4例，9.3%)占比較高。CNV陽性結果臨床資料見表2。本研究總體檢出率為40%(56/140)。針對意義不明的陽性CNV，對父母建議追查CNV，僅CNVP2遵醫(yī)囑進行檢測，其父母均為陰性，則此CNV為新發(fā)(denovo)。

A：100%MCC的樣本QF-PCR結果(樣本編號ET-8)，4組峰圖中，上為母源樣本，下為胚胎樣本 B：三倍體的QF-PCR結果(樣本編號ET-6)，4組峰圖中，上為母源樣本，下為胚胎樣本 C：三倍體FISH驗證結果(樣本編號ET-6，自上而下分別為13/21號、16/22號、18/X號染色體信號)，結果顯示13、16、18、21、22和X染色體各有三個信號點圖1 QF-PCR檢測示例

表2 CNV陽性結果臨床資料

2.4 統(tǒng)計學分析

按照單次和復發(fā)性(≥2次)不良孕產史對全部病例進行分組，分別為單次組83例(早孕期77例，中孕期6例)和多次組60例(早孕期54例，中孕期6例),兩組的檢測總陽性率分別為42.5%(34/80，MCC樣本排除)和36.7%(22/60)，差異不具統(tǒng)計學意義(χ2=0.4861，P=0.486)。有不良生活習慣(吸煙)和化學藥品/輻射暴露的為22例，無不良生活習慣(吸煙)和化學藥品/輻射暴露的為118例(MCC樣本排除)，兩組陽性率分別為31.8%(7/22)和11.0%(13/118)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.552，P=0.01)。

3 討論

近年來，多個研究結果表明，WGS能夠作為一線方法檢測非整倍體和拷貝數(shù)變異，相比傳統(tǒng)的染色體核型分析和FISH技術，對于小片段缺失重復、某些嵌合體的檢出有明顯優(yōu)勢[2，8，10]；但是，WGS也有其技術的局限性，如無法檢出染色體平衡結構畸變、三倍體及單親二體性等。此外，檢測早孕期流產組織物標本，在取樣時，由于操作經驗不足或不慎，有一定的MCC風險。而利用QF-PCR同時檢測母體和胚胎來源標本的多組STR位點，既能鑒定是否存在MCC，也能提示三倍體異常[6]。因此，建議在使用WGS檢測流產組織物前先做QF-PCR檢測。

本研究中，總陽性檢出率、非整倍體發(fā)生幾率序列與以往研究結果接近[2，8，11]。以是否為復發(fā)性流產分組，兩組檢測陽性率差異無統(tǒng)計學意義，這可能與陽性樣本中以非整倍體為主有關；以是否有不良生活習慣/暴露史分組，兩組的檢測陽性率差異有統(tǒng)計學意義，說明不良生活習慣和暴露史，在早中孕期不良孕產中，可能是胚胎發(fā)生遺傳學畸變的一個誘因。在CNV檢測陽性病例中，有4例(CNVP1、CNVP3、CNVP4、CNVP7)是明確致病性的，其中CNVP3的chr15重復源自母體的平衡易位，此結果對于該對夫妻再次妊娠選擇產前診斷或植入前診斷有指導意義；其它3例也建議返診檢查夫妻雙方的染色體，以明確其變異來源。另有1例同時含有3個CNV，其中chr16:p13.11(15110001-16510001)x3覆蓋了16p13.11微重復綜合征90%的區(qū)域，但該綜合征也存在外顯不全現(xiàn)象，不能明確與本例胚胎停育有關[12]。對于臨床意義不能明確的6例CNV(CNVP2、CNVP5、CNVP6、CNVP8、CNVP9、CNVP10)，檢查夫妻雙方是否存在相應的CNV，可以幫助進一步確定其致病性。其中，CNVP2經檢測證實為de novo，懷疑為可能致病性CNV，經查DECIPHER數(shù)據(jù)庫(https://decipher.sanger.ac.uk/)，有若干與此CNV部分區(qū)域重疊的來源于患者的小CNV(均<1Mb)，都包含一個核心OMIM基因ADGRL4，而這些CNV是否為致病性，還需要針對這個基因的劑量效應進行機制研究加以證實；遺憾的是，其它陽性家庭并未遵醫(yī)囑進行相應檢測，對后續(xù)研究和患者的溝通提出了更高的要求。

對檢測結果為陰性的病例，還有可能是基因水平突變所致異常，近年有研究利用全外顯子測序(WES)方法檢測流產組織物或患有復發(fā)性流產的孕婦，檢出了一些相關突變[13-14]，但其機制尚需進一步研究。此外，遺傳檢測陰性的早孕期稽留流產還可能和內分泌水平、免疫學因素以及感染等相關，也需要結合臨床及實驗診斷加以明確。

綜上所述，本研究利用WGS結合QF-PCR的方法，有效檢出了早、中孕期流產組織物的遺傳學異常，可以為患者的優(yōu)生優(yōu)育提供可靠的指導依據(jù)。