侯玉潔， 徐 俊，王淑清， 劉昌林， 郭小澤，楊宗英， 曾柳根， 雷小青， 熊春賢， 鄧敏超， 許亮清*

（1.南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌 330008；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西南昌 330200；3.南昌市動物疫病預(yù)防控制中心，江西南昌 330008；4.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西南昌 330200；5.新建區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西南昌 330100）

纖維在瘤胃微生物作用下降解為揮發(fā)性脂肪酸為機(jī)體供能，而飼糧是影響瘤胃微生物組成和多樣性的關(guān)鍵因素 （Shawrang等，2013；Wilson等，1997），牧草化學(xué)組成和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的差異造成了瘤胃降解率的不同，而吸附在細(xì)胞壁上的細(xì)菌是影響降解的關(guān)鍵因素（Saro等，2012）。徐俊等（2015）研究指出，不同牧草組織結(jié)構(gòu)存在顯著差異，微生物對細(xì)胞壁的吸附和降解與牧草組織結(jié)構(gòu)和類型密切相關(guān)，黃色瘤胃球菌（R.flavefaciens）、白色瘤胃球菌（R.albus）和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌 （F.succinogenes）是三種主要纖維分解菌（Koike 等 ，2006；Krause 等 ，2006；Tajima 等 ，2001），他們對植物細(xì)胞壁的降解作用已通過電子顯微鏡觀察得到了充分證實 （Jung等，2001；Akin等，1975）。研究發(fā)現(xiàn)羊茅草和鴨茅草中纖維分解菌有70%屬于F.succinogenes和R.flavefaciens（Cheng 等，1984；Akin 等，1980），分別占細(xì)菌總量的0.1% ～6.6%和1.3% ～2.9%（Krause等，1999；Lin 等，1994）。Thoetkiattikul等（2013）利用高通量測序技術(shù)研究不同纖維和淀粉比例飼糧對奶牛瘤胃微生物特性的影響發(fā)現(xiàn)，瘤胃中主要的細(xì)菌包括擬桿菌門、硬壁菌門和變形菌門，且細(xì)菌豐富度與飼糧纖維含量密切相關(guān)。

目前，研究多集中在對幾種主要纖維分解菌數(shù)量變化的分析上（Ghasemi等，2012），通過高通量測序手段對嵌在牧草細(xì)胞壁內(nèi)部微生物多樣性的研究鮮有報道。 徐俊等（2016、2014、2013）報道的牧草莖稈各時間點降解率變化及掃描電鏡圖片結(jié)果顯示，牧草在降解24 h后的組織結(jié)構(gòu)變化最大，因此，本試驗通過高通量測序手段進(jìn)一步從微生物角度探究吸附在牧草細(xì)胞壁的微生物多樣性，以期更加真實、全面地反映降解牧草細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥品 糞便總基因組提取試劑盒 QIAamp DNAstool mini ki（QIAGEN，51504）；Pyrobest DNA Polymerase（TAKARA，Japan）；瓊脂糖（Invitrogen，75510-019）；DNA 膠回收純化試劑盒 Axy Prep DNA Gel Extration kit （Axygen，APGX-500）；文庫檢測及定量試劑盒 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen，P7589）；測序試劑盒 Miseq keagent kit v2 （Illumina，MS-102-2003）；構(gòu)建測序文庫試劑盒Agencourt AMPure XP Beads （Illumina，A63881） 和 TruSeqTMDNA Sample Prep kit-SetA （Illumina，MS-102-2003）；蛋白酶 K（TaKaRa，DRR006B）；無水乙醇（天津科密歐）；異丙醇（色譜級）；雙蒸水。

1.2 主要儀器和設(shè)備 -80℃超低溫冰箱（BCD-208K ACJN），青島海爾股份有限公司；制冰機(jī)（FMB-70），無錫沃信儀器有限公司；冷凍離心機(jī)（5810R），德國 Eppendorf公司；高壓滅菌鍋（LDZX-50KBS），上海申安醫(yī)療器械廠；凝膠成像系統(tǒng)（BS60chamGel 1600），西化儀科技有限公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；PCR儀，德國Eppendorf公司；酶標(biāo)儀 （FLX800），美國伯騰（BioTek）儀器有限公司；安捷倫2100分析儀，美國安捷倫（Agilent）科技公司；Illumina-Misep DNA測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 試驗動物和飼養(yǎng)管理 選取3頭安裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛[（600±15）kg]，飼喂主要由玉米青貯和秸稈組成的全混合日糧，栓系式飼養(yǎng)，日喂兩次，自由飲水。

1.4 試驗材料 本試驗選用長勢和株高相近的初花期紫花苜蓿、抽穗初期燕麥草和羊草以及收割后的稻草秸稈，從根部切割后去掉葉子和葉鞘，剝離出莖稈作為試驗材料。

1.5 試驗步驟 分別稱取3.0 g粉碎好的莖稈樣品（2 mm 篩）放入尼龍袋（8 cm×12 cm，網(wǎng)孔孔徑300目）中，于晨飼前分別投放到奶牛瘤胃中，將尼龍繩固定在瘺管蓋上。瘤胃中降解24 h后取出所有尼龍袋，放入冰水中停止發(fā)酵，用冷水沖洗直到流出的水澄清為止，將樣品放入-80℃低溫冰箱中保存。

根據(jù)細(xì)菌16SrDNA基因V3區(qū)的保守序列，設(shè) 計 通 用 引 物 338F：5＇ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3＇，533R：5＇ -TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3＇。試驗中12個樣品的Barcode序列如表1所示，PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系，體系組成如表2所示。

表1 樣品Barcode序列

表2 PCR擴(kuò)增體系

PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行21個循環(huán)；最后72℃延伸5 min；結(jié)束時4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，然后使用Axygen DNA膠回收純化試劑盒 （Axy Prep DNA Gel Extration kit，AP-GX-500）對 V3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，經(jīng)Biotek酶標(biāo)儀對純化好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，將樣品等量混勻后形成均一混合物。PCR混合物經(jīng)質(zhì)量控制后，采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina TruSeq DNA文庫制備流程構(gòu)建Illumina測序文庫，最后按照Illumina Miseq平臺上機(jī)進(jìn)行Barcoded Illumina Miseq測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 測序結(jié)束后，對原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制得到有效序列，再對有效序列進(jìn)行去雜處理，丟棄長度短于120 bp、含有模糊堿基，引物堿基含2個以上的錯配信息、單個堿基重復(fù)數(shù)超過6個的序列，最終獲得用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。通過Qiime分析平臺對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)序列相似度為97%的原則，將序列歸為多個操作分類單元（OTU）。然后對序列進(jìn)行聚類分析，選取每個類最長序列為代表序列，采用RDP-classifier，以RDP數(shù)據(jù)庫的序列為訓(xùn)練集，對OTU代表序列進(jìn)行注釋，得到每個OTU的分類學(xué)信息。通過軟件Mothur（http：//www.mothur.org）對生成的OTU信息進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析。

數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行整理，結(jié)果采用SAS統(tǒng)計軟件的PDIFF模塊進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌豐富度和多樣性 通過Illumina Miseq高通量測序后，本研究12個樣品共產(chǎn)生有效序列591378條，經(jīng)質(zhì)量控制后得到562727條高質(zhì)量序列，每個樣品平均產(chǎn)生46894條序列，平均序列長度為161 bp。

為了研究不同牧草經(jīng)瘤胃細(xì)菌降解后的菌群結(jié)構(gòu)多樣性，采用Chao和Ace指數(shù)計算群落物種豐富度，用Shannon和Simpson指數(shù)計算群落結(jié)構(gòu)多樣性。樣品在97%相似性水平下的測序覆蓋深度用Good’coverage計算。12個樣品在97%相似性水平下的序列數(shù)和多樣性指數(shù)如表3所示。

Rarefaction curve和Shannon多樣性曲線可以反映該測序量和97%相似度OTU水平下文庫的生物多樣性。從圖1可知，OTU數(shù)目隨測序量的提高不斷提高，當(dāng)測序量到達(dá)一定程度時，OTU增加趨勢變得緩慢，但仍未達(dá)到飽和，說明隨著測序量的深入，可檢測到瘤胃中大部分菌種，但仍有少部分新的物種有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。上述結(jié)果表明，增加測序量仍然可能發(fā)現(xiàn)新的菌種，但本試驗測序量基本可以反映瘤胃內(nèi)細(xì)菌的多樣性情況。

在Rank abundance曲線中，對各樣品的OTU進(jìn)行豐度排序，對豐度值取log2的對數(shù)值做出Rank abundance曲線圖，如圖2可知，12個樣品中均發(fā)現(xiàn)存在一條很長的尾巴，這說明降解不同牧草的細(xì)菌群落中存在大量低豐度的菌種，這也再次說明，使用高通量測序手段可以更加真實、全面地反映降解牧草細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

表3 12個牧草樣品在97%相似性水平下豐富度和多樣性指數(shù)

圖1 97%相似性水平下12個牧草樣品的稀釋曲線

圖2 12個牧草樣品豐度分布曲線圖

2.2 細(xì)菌組成和群落結(jié)構(gòu) 本試驗采用RDP和BLAST同源性序列比對所有樣品序列鑒定得到16個門，27個綱，37個目，63個科和91個屬。由圖3可知，在門水平上，各牧草組均以硬壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋體門（Spirochaetes）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）和變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌門，他們的比例均占序列總數(shù)的1%以上，其中，硬壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）平均占序列總數(shù)的42.22%（39.02% ～46.49%）和19.86%（17.65% ～21.42%）。無壁菌門 （Tenericutes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、酸桿菌門（Actinobacteria）、TM7、疣微菌門（Verrucomicrobia）和 SR1、梭桿菌門（Fusobacteria）、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）和廣古菌門（Euryarchaeota）序列含量都低于1%。

由表4可知，門水平下，相對含量大于0.1%的門共有11個，其余5個門含量均低于0.1%，豐度較低。此外，還有平均3.23%（1.22%～6.68%）的序列無法進(jìn)行歸類。統(tǒng)計結(jié)果表明，各牧草組均以硬壁菌門 （Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）比例最高，其中硬壁菌門（Firmicutes）在苜蓿、燕麥草、羊草和稻草中的比例分別占序列總數(shù)的46.49%、40.34%、39.02%和43.03%，擬桿菌門 （Bacteroidetes）在上述四組牧草中分別占20.69%、17.65%、21.42%和19.68%，不同牧草中硬壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）比例存在極顯著差異 （P＜0.01）。剩余的9個門中，除了 TM7、SR1 和疣微菌門（Verrucomicrobia）各牧草組間無顯著差異外（P＞0.05），其余均存在極顯著差異（P＜0.01）。由此可見，瘤胃中降解不同牧草的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

圖3 基于門水平12個牧草樣品中細(xì)菌和古細(xì)菌相對含量（序列所占比例）

表4 基于門水平相對含量大于0.1%（序列所占比例）的不同牧草比較分析

3 討論

瘤胃中細(xì)菌和真菌可以分泌多種活性很高的纖維降解酶，其占纖維酶活力的80%以上（Dijkstra等，1995）。盡管真菌的穿透力和降解能力更強(qiáng)，且可以溶解部分木質(zhì)素，但真菌在瘤胃微生物中的含量較低（占8%），因而對纖維降解的貢獻(xiàn)低于細(xì)菌，細(xì)菌由于數(shù)量上的絕對優(yōu)勢，使其在纖維降解過程中起到關(guān)鍵作用。瘤胃中細(xì)菌可分為瘤胃液中的游離細(xì)菌，與飼料顆粒緊密吸附的細(xì)菌和附著于瘤胃壁上的細(xì)菌（McAllister等，1994；Czerkawski等，1988）。瘤胃中88% ～91%的葡糖糖內(nèi)切酶和木聚糖酶，70%的淀粉酶和75%的蛋白酶活通過飼料顆粒中緊密吸附的微生物分泌（Minato 等，1993），因此，與牧草莖稈緊密吸附的微生物才是降解纖維的關(guān)鍵菌群 （Miron等，2001），他們占瘤胃中纖維分解菌數(shù)量的70%～80%（Craig 等，1987）。

通過對測序數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，在當(dāng)前測序量前提下，不同牧草樣品的稀釋曲線仍不能完全進(jìn)入平臺期（圖1），上述結(jié)果表明，增加測序量仍然可能發(fā)現(xiàn)新的種系型，但本試驗測序量基本可以反映緊密吸附在牧草纖維上細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性。四組牧草中共產(chǎn)生8997個OTU，燕麥草獲得的OTU數(shù)目最高，羊草最低，在97%相似性水平下豐富度指數(shù)Chao和Ace也是燕麥草最高，羊草最低，這可能是因為燕麥草優(yōu)質(zhì)序列數(shù)更高，降解率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同為禾本科的羊草，且附著在燕麥草和羊草中的細(xì)菌數(shù)量不同。

序列比對后發(fā)現(xiàn)，牧草吸附的細(xì)菌中硬壁菌門和擬桿菌門平均占序列總數(shù)的42.22%和19.86%，這與奶牛瘤胃液中兩菌門也是優(yōu)勢菌群相一致（Jami等，2012）。牧草莖稈中主要成分是纖維素，而硬壁菌門含有大量分解纖維的菌屬，如丁酸弧菌屬和瘤胃球菌屬，這充分說明了硬壁菌門為何在牧草緊密吸附的菌群中占據(jù)絕對優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本試驗通過高通量測序法研究了吸附在牧草細(xì)胞壁降解菌的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：（1）吸附于不同牧草細(xì)胞壁中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富度：燕麥草>苜蓿>稻草>羊草；（2）四組牧草樣品共鑒定得到16個門，27個綱，37個目，63個科和91個屬。門水平上，硬壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門、纖維桿菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門。綜上：不同牧草吸附的細(xì)菌種類和數(shù)量存在顯著差異。