池苗苗 王亞坤 謝長生

胃癌是常見惡性腫瘤之一。抗人類表皮生長因子受體2（HER2）單克隆抗體曲妥珠單抗（Trastuzumab，商品名：赫賽汀，Herceptin）對 HER2 陽性胃癌有明顯的臨床意義。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路的異常激活對胃癌的發(fā)生起著重要的作用[1]，可受HER2調(diào)控，活化的AKT又可激活下游的雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路異常激活后，可發(fā)生腫瘤疾病，并與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)[2]。南方紅豆杉（taxus chinensis var.mairei）具有較高的抗腫瘤作用。本實驗通過建立人胃癌HER2陽性移植瘤模型裸鼠，研究南方紅豆杉水提物對PI3K/AKT信號通路相關(guān)靶點的作用，并從mRNA及蛋白表達(dá)水平對其機制進(jìn)行初步探討，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物與瘤株 4～6周齡BALB/c裸鼠80只，體質(zhì)量18～20g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：[SCXK（滬）2013-0016]。人胃癌HER2陽性細(xì)胞株NCI-N87購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物與試劑 南方紅豆杉購自寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司（規(guī)格：8g/袋，批號 100513）。曲妥珠單抗：購自上海羅氏公司（規(guī)格：440mg/瓶，批號N3586）。GIBCO胎牛血清購自美國GIBCO公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 蛋白印跡檢測系統(tǒng)由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，多功能全波長酶標(biāo)儀系統(tǒng)由美國Thermo公司生產(chǎn)，定量PCR儀器由美國ABI公司生產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 南方紅豆杉水提物制備 取13袋南方紅豆杉（8g/袋）置于醫(yī)用不銹鋼鍋中，冷水中充分浸泡過夜，置入控溫電爐，第一遍時加入藥物7倍量的冷水煮沸20min，煮沸后倒出藥液，第二遍時加入藥物5倍量的煮沸20min，倒出藥液，合并兩次煎液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至終濃度為208mg（生藥量）/mL，靜置過夜后用濾網(wǎng)過濾藥渣，將過濾液作為高劑量母液，按照1：2和1：4體積分別稀釋為中劑量104mg（生藥量）/mL和低劑量52mg（生藥量）/mL，藥物保存在4℃冷藏冰柜。

2.2 赫賽汀溶液制備 用20mL滅菌注射用水配制成無色至淡黃色的透明液體作為母液，母液濃度為21mg/mL，4℃冰箱保存。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1～2天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，加2mL 0.25%胰酶-EDTA消化，置于培養(yǎng)箱10～15min，待細(xì)胞全部脫落加培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液移至離心管，800rpm離心5min，棄上清液，重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中按1:2比例進(jìn)行傳代，每3～5天傳代1次。

2.4 建立模型、分組給藥 取1×107個/mL的NCIN87單細(xì)胞懸液接種裸鼠右側(cè)腋窩下，接種后第七天觀察瘤體情況并將80只BALB/c裸鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、紅豆杉高劑量組、紅豆杉中劑量組、紅豆杉低劑量組、赫賽?。℉erceptin）聯(lián)合紅豆杉（高、中、低）劑量組，Herceptin單藥組，共8組，每組10只。實驗中共有4只裸鼠死亡，從相應(yīng)組別中剔除。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》計算，紅豆杉低、中、高劑量分別為：成人劑量的 5 倍（0.520g·kg-1·d-1），成人劑量的 10 倍（1.040g·kg-1·d-1），成人劑量的20 倍（2.080g·kg-1·d-1），灌胃，共給藥 3 周。根據(jù)前期實驗及參考文獻(xiàn)[3]，Herceptin組首劑按40mg/kg腹腔注射給藥，每7天1次，后2次按20mg/kg給藥，共給藥3次。聯(lián)合組同時灌胃給藥，每次3mL，共給藥3周。接種后第28天取瘤用于檢測。

2.5 Western Blot檢測蛋白表達(dá) 取適量瘤組織加入RIPA裂解液（含PMSF），進(jìn)行勻漿再置于冰上。裂解30min后進(jìn)行4℃下12000r/min離心5min，提取蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，等量上樣；然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳；最后用Quantity one圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.6 實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá) 取移植瘤組織約50mg進(jìn)行組織總RNA提取和純化，進(jìn)行RNA濃度測定，OD260/OD280為1.8～2.2之間。引物設(shè)計及合成由上海生工公司提供。PI3K（p110α）mRNA上游引物序列為：5’-ACACCACGGTTTGGAC TATGG-3’，下游引物序列為：5’-GGCTACAGTAGT GGGCTTGG-3’，AKT1 mRNA 上游引物為：5’-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3’，下游引物為：5’-TT GTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3’，mTOR mRNA 上游引物為：5’-ACCGGCACACATTTGAAGAAG-3’，下游引物為：5’-CTCGTTGAGGATCAGCAAGG-3’。

各組裸鼠移植瘤組織總RNA提取和cDNA合成按試劑說明書操作。使用ABI熒光定量PCR儀器進(jìn)行，每個樣品取2μL作為模板。反應(yīng)體系：上下游引物各 0.4μL，DNA 樣品 2μL，ddH2O6.8μL，SYBR Premix Ex TapTM10.0μL。PCR循環(huán)結(jié)束后，樣品加熱到95℃馬上降至60℃并保持15s，然后按照1.75℃·s-1遞增到95℃，在升溫時收集熒光信號，建立熔解曲線。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA），方差齊性采用 LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 Western Blot檢測各組瘤組織 PI3K、pAKT、mTOR蛋白表達(dá) 應(yīng)用Quantity one軟件分析并與β-actin灰度值比值顯示結(jié)果（見表1、插頁圖1）。與對照組比較（插頁圖1-1），紅豆杉中、低劑量組PI3K蛋白相對表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）；與赫賽汀組（Herceptin）比較，紅豆杉中劑量聯(lián)合赫賽汀組PI3K蛋白相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；紅豆杉中劑量聯(lián)合赫賽汀組PI3K蛋白相對表達(dá)量較紅豆杉高、低劑量聯(lián)合組顯著降低（P＜0.05）。與對照組比較（插頁圖1-2），紅豆杉單藥組pAKT蛋白表達(dá)相對量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；紅豆杉高劑量組較紅豆杉中、低劑量組pAKT蛋白表達(dá)相對量顯著降低（P＜0.05）；與對照組比較，紅豆杉聯(lián)合赫賽汀組pAKT 蛋白相對表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），紅豆杉聯(lián)合組組間差異不顯著（P＞0.05）。與對照組比較（插頁圖1-3），紅豆杉各組mTOR蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；紅豆杉單藥各組紅豆杉高、低劑量組mTOR蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與對照組比較，紅豆杉各劑量聯(lián)合赫賽汀組及赫賽汀組mTOR蛋白表達(dá)極顯著降低（P＜0.01）。與赫賽汀組比較，紅豆杉高劑量聯(lián)合赫賽汀組OTOR蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），紅豆杉聯(lián)合赫賽汀各組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 各實驗組PI3K、pAKT、mTOR蛋白表達(dá)

圖2-1 PI3K mRNA擴增曲線圖

圖2-3 AKT1 mRNA擴增曲線圖

圖2-5 mTOR mRNA擴增曲線圖

圖2-2 PI3K mRNA溶解曲線圖

圖2-4 AKT1 mRNA溶解曲線圖圖2 各組PI3K、APT1、mTOR mRNA表達(dá)

圖2-6 mTOR mRNA溶解曲線圖

3.2 實時熒光定量PCR法檢測各組瘤組織PI3K、AKT1、mTOR mRNA表達(dá) 結(jié)果顯示，與對照組比較，紅豆杉低劑量組PI3K mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），紅豆杉聯(lián)合組及赫賽汀組PI3K mRNA表達(dá)顯著降低（P均＜0.01）。與赫賽汀組比較，紅豆杉高、中、低劑量聯(lián)合赫賽汀組PI3K mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），與對照組比較，紅豆杉單藥組AKT1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；紅豆杉高、中劑量組AKT1 mRNA表達(dá)較紅豆杉低劑量組顯著降低（P＜0.05）；紅豆杉高、中、低聯(lián)合赫賽汀組 AKT1 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與赫賽汀組比較，紅豆杉聯(lián)合赫賽汀各組AKT1 mRNA表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）；紅豆杉聯(lián)合組組間差異不顯著（P＞0.05）。與對照組比較，紅豆杉中、低劑量組mTOR mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），紅豆杉聯(lián)合赫賽汀各劑量組及赫賽汀組mTOR mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與赫賽汀組比較，紅豆杉聯(lián)合赫賽汀各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2。

表1 各組瘤組織PI3K、pAKT、mTOR蛋白表達(dá)量比較（x±s）

表2 各組瘤組織PI3K、AKT1、mTOR mRNA表達(dá)量比較（x±s）

4 討論

HER2屬于表皮生長因子受體（EGFR）家族，是一種原癌基因，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有密切聯(lián)系[4]。其中曲妥珠單抗是重組的人源化抗HER2的單克隆抗體，通過抑制HER2參與的信號傳導(dǎo)[5-6]，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，并且可以在HER2高表達(dá)的NCI-N87胃癌細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）效應(yīng)而殺傷靶細(xì)胞[7-8]，從而增強抗腫瘤活性。PI3K/AKT/mTOR信號通路激活可受HER2調(diào)控，HER2通過活化PI3K，催化第二信使 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3），在 PDK1和mTORC2作用下激活下游的AKT，調(diào)節(jié)細(xì)胞抗凋亡[9-10]。活化的AKT進(jìn)一步激活下游因子，如mTOR，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡和新生血管生成。AKT的三個亞型有80%以上的氨基酸序列同源性，相似的結(jié)構(gòu)，存在共同結(jié)構(gòu)特征于三個不同的功能區(qū)域，三個亞型均參與下游底物的活化[11]，其中AKT1促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖并在，并在腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞生長、增殖過程中起重要作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路的阻斷，可以通過抑制此信號通路上的各個靶點，例如siRNA靶向阻斷I型PI3K，從而阻斷PI3K信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]。另外，通過抑制AKT的激活，從而進(jìn)一步抑制下游信號靶點的激活導(dǎo)致信號通路的阻斷[13-14]，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

本實驗結(jié)果表明，不同劑量南方紅豆杉水提物能部分下調(diào)PI3K、pAKT、mTOR表達(dá)，中、低劑量組下調(diào)PI3K、mTOR表達(dá)較高劑量組明顯，高劑量組下調(diào)pAKT較中、低劑量組明顯，起到抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，從而抑制腫瘤的生長，但不同劑量南方紅豆杉水提物對相同靶點的作用結(jié)果存在著差異，且紅豆杉聯(lián)合赫賽汀后較紅豆杉單藥組下調(diào)各靶點的表達(dá)更顯著，這些差異提示雖然部分抑制了此信號通路的激活，HER2陽性胃癌仍可以通過其他信號通路起到增殖作用。從而得出南方紅豆杉水提物能通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制HER2陽性胃癌移植瘤生長，也可能存在作用于除PI3K/AKT/mTOR信號通路外其他旁路或下游通路等從而抑制HER2陽性胃癌的發(fā)展。