楊煜鴻 張曉怡 王佳寧 陳卓峰 郭燕嫻 許憶恩 趙經(jīng)哲 黎鵬 王森（通訊作者）

（廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室 廣東 東莞 523808）

1.引言

宮頸癌（Cervical Cancer， CC）是女性常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性生命健康。目前認(rèn)為，宮頸癌與HPV感染關(guān)系密切，這一過程伴隨著長期慢性炎癥及其誘發(fā)的細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)異常[1]。Bim是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，具有助凋亡活性，同時也具有腫瘤抑制因子的活性，Bim基因的缺失可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生[2]。本研究擬初步探討宮頸癌細(xì)胞中RUNX2對Bim的調(diào)控作用。RUNX2屬于Runxx蛋白家族一員，對腫瘤的侵襲能力具有重要的促進(jìn)作用，RUNX2在宮頸癌、乳腺癌、肝癌的表達(dá)量明顯增加，其異常表達(dá)與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展同樣密切相關(guān)[3]。然而，宮頸癌細(xì)胞中RUNX2對Bim的調(diào)控情況尚未清楚。因此，本實驗初步探討了RUNX2對Bim表達(dá)的影響，為進(jìn)一步降低CC的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療提供新的線索。

2.材料和方法

2.1 材料

宮頸癌Hela細(xì)胞和C33a細(xì)胞由本實驗室保存。RUNX2表達(dá)載體由本課題組前期構(gòu)建。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Hilymax購自同仁化學(xué)研究所。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑購買自大連Takara 公司。PCR引物委托上海生工合成和測序。實時定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司，PBS粉末劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液購自上海生工。

2.2 實驗方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 宮頸癌細(xì)胞置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24h取對數(shù)生長期的C33a細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按每孔3×105個細(xì)胞的數(shù)量鋪于6孔板中，設(shè)對照組和RUNX2組兩組。以3μg質(zhì)粒：15μL Hilymax的濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4h換液，繼續(xù)培養(yǎng)，等待后續(xù)實驗。

2.2.2 總RNA 用TRIzol法提取，合成cDNA進(jìn)行熒光實時定量PCR反應(yīng)。Realtime PCR反應(yīng)體系如下：首先取1μL cDNA作為模板，加入10μL SYBR Green Mix、0.8μL 10μmol/L上游引物、0.8μL 10μmol/L下游引物，7.4μLddH2O，混勻后以20μL體系進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。引物序列：Runx2-F，5’-TCTTCACAAATCCTCCCC-3’；Runx2-R，5’-TGGATTAAAAGGACT TGGTG-3’；Bim-F Primers 5’-CAGACAGGAGCCCAGCACC-3'，Bim-R Primers 5’-TCCAATACGCCGCAACTCTT-3'.反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s、58℃退火30s、60℃延伸1min共40個循環(huán)。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS19.0軟件分析實驗結(jié)果，使用兩獨立樣本t檢驗（雙側(cè)）進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1 C33a細(xì)胞過表達(dá)RUNX2下調(diào)了Bim的mRNA表達(dá)

將過表達(dá)RUNX2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌C33a細(xì)胞后48h，提取總RNA，進(jìn)行 qPCR實驗檢測RUNX2和Bim基因的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對照組相比，過表達(dá)組RUNX2 mRNA上升約41.2%（P＜0.05），表明C33a細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了RUNX2基因。與對照組相比，BimmRNA降低約31.83%（P＜0.05），提示C33a細(xì)胞中RUNX2可以下調(diào)Bim基因mRNA的表達(dá)，見圖1。

3.2 Hela細(xì)胞過表達(dá)RUNX2下調(diào)了Bim的mRNA表達(dá)

結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)組RUNX2 mRNA上升約61.72%（P＜0.05），表明Hela細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了RUNX2基因。而Bim mRNA降低約40.01%（P＜0.05），提示RUNX2可以下調(diào)Bim基因mRNA的表達(dá)，見圖2。

4.討論

Runx2屬于Runxx蛋白家族一員，由α和β亞單位組成的異二聚體構(gòu)成，定位于人染色體6p12.3-p21.1。Runx2同時也是多瘤病毒增強(qiáng)子結(jié)合蛋白2/核心結(jié)合因子轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在癌細(xì)胞中RUNX2可調(diào)節(jié)與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)[4]。研究證實，在宮頸鱗癌組織中，RUNX2蛋白的陽性表達(dá)率高于正常宮頸黏膜組織；且癌組織臨床分期越高，其陽性表達(dá)率越高。另外，在宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）組織中，RUNX2也高表達(dá)，但低于宮頸鱗癌組織[5]?？梢?，RUNX2蛋白高表達(dá)與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

Bim是Bcl-2促凋亡蛋白家族成員之一，Bim基因作為抑癌基因，其沉默可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡通路的失敏，促使多種腫瘤的發(fā)生[6]。在目前研究中，通過免疫組化可評估在宮頸癌中BIM表達(dá)的相關(guān)性和預(yù)后意義。與正常子宮頸和低宮頸上皮內(nèi)瘤（CIN）相比，在高CIN和宮頸癌中BIM高度表達(dá)[7]?？梢?，高Bim表達(dá)是宮頸癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物以及化學(xué)治療靶標(biāo)。

為了解Runx2對Bim的調(diào)控作用，我們應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測過表達(dá)Runx2的宮頸癌C33a細(xì)胞和Hela細(xì)胞Bim的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示較之于對照組，本實驗中的宮頸癌C33a細(xì)胞和Hela細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了Runx2基因；過表達(dá)Runx2下調(diào)了Bim的mRNA表達(dá)。宮頸癌細(xì)胞中RUNX2能夠抑制Bim的表達(dá)，可能藉此途徑抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)RUNX2抑制了Bim的表達(dá)，為將來進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)，也為宮頸癌防治提供潛在治療靶點。

圖1

圖2