胡 陳，孫劍會，甘樂彬，劉 迪，張安強，黃 宏，杜 娟，文大林，陳民佳，陸紅祥，曾 靈，張華才，蔣建新

肺臟作為可行氣體交換的器官，經(jīng)常遭受外界環(huán)境中微生物和毒素的損傷[1]。受損傷肺臟需修復重建肺泡結(jié)構(gòu)[2-3]。肺泡是機體氣體交換的場所，同時也是肺臟呼吸系統(tǒng)的基本單位。肺泡主要由介導氣體交換的扁平一型上皮細胞和分泌表面活性蛋白的立方二型上皮細胞構(gòu)成[4]。極少數(shù)肺泡二型細胞具有肺泡干細胞的功能，目前肺泡二型細胞作為干細胞參與肺損傷修復的機制仍不清晰。其中肺泡一型上皮細胞占肺泡表面積>95%，有研究[5]表明一型上皮細胞在肺損傷后具有可塑性。急性肺損傷模型可模擬肺臟遭受損傷后的狀態(tài)，為后續(xù)研究肺泡上皮細胞參與損傷修復提供良好條件[6]。該研究采用鼻飼法滴注脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)直接對肺臟構(gòu)成損傷，建立急性肺損傷動物模型，操作方法簡便，對小鼠創(chuàng)傷小，并揭示肺損傷修復不同時間點的動態(tài)變化。

材料與方法

1 實驗動物

10～12周齡C57BL/6雄鼠36只，體重23～26g，由北京中國科學院動物研究所[許可證號SYXK(京)2007-0004]提供。小鼠飼養(yǎng)1周左右以適應新環(huán)境，給予充足的飼料和飲水，按隨機數(shù)字表法分為生理鹽水組(6只)和LPS損傷組(30只)，LPS損傷組又分為損傷后3d(LPS-d3)、5d(LPS-d5)、7d(LPS-d7)、9d(LPS-d9)、11d(LPS-d11)5組，每組6只小鼠。

2 主要試劑和儀器

手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械，中國)，移液器(200uL，Gilson，法國)，注射器(1mL，上海金塔，中國)，F(xiàn)ES-2000B 電子秤(福州富日，中國)，渦旋混勻儀(IKA，德國)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，LPS(Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5，sigma，貨號：L4005)，肝素鈉注射液(萬邦醫(yī)藥，中國)，戊巴比妥鈉(上海醫(yī)藥，進口分裝)。

3 實驗方法

3.1鼻飼法滴注LPS建立急性肺損傷模型 小鼠腹腔注射60mg/kg 2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，麻醉深度為中度(昏迷但掐尾有反應)；根據(jù)小鼠體重按10mg/kg的劑量，計算10mg/mL濃度的LPS的給藥體積(總體積控制在30～50μL最佳)；移液器精確吸取所需滴注液體的體積，右手拉住小鼠尾巴，左手拇指和食指抓住小鼠耳朵，控制住小鼠的頭部，輕輕推移液器，槍頭可見吸取的小液滴(約2μL/滴)，輕輕靠向小鼠右鼻孔，左手立刻快速有力度的向上提30～40cm，再緩慢輕輕回到左手起始位置(小鼠始終保持鼻孔朝上)，進行來回10次，然后同樣的操作向小鼠左鼻孔滴加小液滴，左右鼻孔依次滴加，直至液體滴注完成，最后松開小鼠，將小鼠利用膠帶固定于鼠板，腹部朝上、頭部朝上傾斜的體位保持30min以上，待小鼠復蘇，放回鼠籠飼養(yǎng)觀察。

3.2小鼠肺大體改變、病理改變、病理評分 LPS滴注后，于3、5、7、9、11d各時間點進行肺組織取材，麻醉小鼠并肝素化后解剖小鼠，肉眼觀察小鼠肺組織大體改變，并取0.3cm×0.3cm×0.5cm左肺組織進行蘇木素-伊紅染色(HE)，光鏡下觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)的變化并對其進行病理評分[7]。

3.3小鼠肺組織肺指數(shù)(肺組織濕重/小鼠體重)的測定 LPS滴注后，于各個時間點進行測定，麻醉后電子天枰稱取小鼠體重并記錄，肝素化并解剖小鼠，游離肺組織，取右肺，濾紙吸干表面水分，電子天枰稱取濕重，計算肺指數(shù)(肺組織濕重/小鼠體重)。

4 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

1 肺大體觀察

LPS滴注3、5、7、9、11d后，與生理鹽水組(圖1a)相比，LPS-d3(圖1b)左右肺均出現(xiàn)肺組織肝樣變，區(qū)域占比為左肺面積40%～50%，右肺面積20%，該肝樣變區(qū)域由肺門處往肺周邊蔓延，具有明顯的分界，肺邊緣粉紅色為正常肺組織；LPS-d5表現(xiàn)為雙肺近肺門處肝樣變出血，區(qū)域占比為左肺面積20%～30%，右肺面積10%～20%，比LPS-d3出血面積減小，出血部位的顏色稍減淡，提示傷后3～5d，肺損傷傷情表現(xiàn)為好轉(zhuǎn)；LPS-d7雙肺近肺門處有肝樣變出血，出血區(qū)域占比為左肺面積<10%，右肺面積<5%，周圍組織呈現(xiàn)正常的粉紅色，與LPS-d5相比肺損傷區(qū)域面積顯著縮小，且損傷區(qū)域顏色稍淺，肺損傷進一步修復；LPS-d9雙肺塊狀肝樣變出血基本消失，僅雙肺肺門有紅色塊狀充血；LPS-d11雙肺未見明顯出血改變，損傷恢復完全。

2 肺組織病理觀察

生理鹽水組，LPS組第3、5、7、9天可見肺泡腔炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚、纖維蛋白滲出的典型病理表現(xiàn)(圖2)，且第3天炎性細胞滲出最嚴重，每個肺泡腔皆≥5個，第5、7、9天逐漸減少，第11天基本未見炎性細胞滲出；LPS損傷后第3天僅見少量纖維蛋白滲出，第5、7天可見肺泡腔內(nèi)大量纖維蛋白滲出，第9天顯著減少，第11天肺泡腔內(nèi)基本未見纖維蛋白滲出。

3 肺組織病理評分及肺體指數(shù)變化

急性肺損傷后不同天數(shù)的肺體指數(shù)與生理鹽水組相比，LPS-d3水腫最重(P<0.05)，后逐漸減輕。肺組織病理評分在肺損傷后急劇升高，LPS-d3最高，后逐漸下降(LPS-d3、LPD-d5、LPS-d7與生理鹽水組相比，P<0.05)(表1)，傷情逐漸恢復。

圖1不同損傷天數(shù)肺大體觀察圖。a.生理鹽水組；b～f分別對應LPS損傷后第3、5、7、9、11天。LPS損傷后第3天(b)傷情最重，表現(xiàn)為雙肺肺門大面積出血(箭頭所指)，后損傷逐漸修復，出血面積逐漸縮小，在第9天(e)基本消失，第11天(f)恢復完全

圖2不同損傷天數(shù)肺組織病理學改變。a.生理鹽水組；b～f.分別對應LPS損傷后第3、5、7、9、11天。與生理鹽水組相比，損傷后第3天傷情最重，主要表現(xiàn)為肺泡腔內(nèi)大量炎癥細胞滲出，第5、7天可見大量纖維蛋白滲出，第9天滲出逐漸減少，第11天基本恢復完全

表1 肺組織病理評分及肺體指數(shù)變化

討 論

急性肺損傷模型的制作方法多，其中氣管滴注是近年來開發(fā)的一種呼吸道給藥方式，如何讓造模操作簡便、成本低廉、模型穩(wěn)定且具有可重復性，一直未有最佳的解決方法。目前國內(nèi)外氣管滴注給藥方式包括暴露式和非暴露式兩種[8]，暴露式主要指頸部切開直接暴露氣管后注射器刺入給藥，此種方法需要切開小鼠頸部皮膚，暴露氣管，注射器刺入氣管，對小鼠自身造成的創(chuàng)傷較大，且切開的皮膚易感染，影響LPS刺激后小鼠的炎癥反應程度，易導致模型不穩(wěn)定，可重復性差；非暴露式給藥主要有經(jīng)氣管插管噴入法和鼻飼法滴入法，經(jīng)氣管插管噴入對操作技術(shù)要求較高，噴入儀器類別、噴入力度、速度、噴入插管的深度都直接影響肺部損傷程度，導致模型不穩(wěn)定，且需配備小鼠專用喉鏡、小鼠插管噴入專用儀器，成本較高。鼻飼法滴注給藥方式，直接通過小鼠鼻孔滴注給藥，利用重力，使藥物經(jīng)過氣管，直達肺部，由于藥物的刺激作用造成肺部損傷，無需有創(chuàng)暴露氣管，對操作技術(shù)要求較低，無需配套實驗專用儀器，操作簡便，容易掌握，可重復性高，模型穩(wěn)定。C57BL/6小鼠在肺組織發(fā)育、病理生理等方面與人類具有高度的同源性，且花費較為低廉，利用C57小鼠通過鼻飼法滴注LPS建立急性肺損傷模型，模型操作簡便，實驗具有一定的科學性和可行性。

LPS誘導的急性肺損傷模型傷情變化規(guī)律主要表現(xiàn)為損傷后第3天傷情最重，肺大體觀察以雙肺肺門處肝樣變?yōu)橹?，顏色表現(xiàn)為深褐色，且與周圍相對較為正常組織分界清楚，肺組織病理則表現(xiàn)為肺泡腔內(nèi)大量炎癥細胞滲出，以中性粒細胞為主，肺泡間隔增厚；第5、7天恢復，肝樣變面積逐漸縮小、顏色逐漸變淺，肺組織病理表現(xiàn)為肺泡腔內(nèi)炎癥細胞顯著減少，但肺泡腔內(nèi)可見纖維蛋白滲出；第9、11天肺大體觀未見肝樣變表現(xiàn)，雙肺肺門處呈現(xiàn)較為正常的粉色肺組織，肺組織病理表現(xiàn)為肺泡腔少量纖維蛋白滲出，未見炎癥細胞滲出。此種損傷修復的變化規(guī)律特點是以炎癥細胞滲出為主，肺泡間隔有增厚，但未見明顯肺泡腔塌陷、上皮細胞脫落等征象[9]。該方法制作的急性肺損傷模型，傷情變化規(guī)律表現(xiàn)為LPS滴入后，出現(xiàn)急性肺損傷表現(xiàn)，肺泡水腫出血，損傷后第3天傷情至最重，后逐漸恢復，損傷后第11天基本恢復完全。

綜上所述，利用操作簡便、成本低廉的鼻飼法滴注LPS建立的急性肺損傷模型的傷情變化規(guī)律可為研究肺損傷修復提供重要實驗基礎(chǔ)。