袁光宇 龔維瑤 羅維超 徐明慧 賈玲玲 謝體波 鐘新敏 程茹

摘要：為開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)煙草（Nicotiana tabacum L.）中的甲霜靈殘留方法，以自制抗原、抗體為材料，研制一種膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，并以甲霜靈原料合成半抗原，進(jìn)一步制備抗原免疫后制備甲霜靈單克隆抗體。結(jié)果表明，紙條檢測(cè)限對(duì)干煙草為1.5 mg/kg，鮮煙葉為1.0 mg/kg，與其他藥物無(wú)交叉反應(yīng)，且與色譜法比較符合率為98%，假陽(yáng)性率為2.3%。甲霜靈殘留試紙條檢測(cè)煙草時(shí)樣品處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員、經(jīng)濟(jì)適用等特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)煙草快速、準(zhǔn)確、批量檢測(cè)，可為煙草中甲霜靈殘留檢測(cè)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：煙草（Nicotiana? tabacum L.）;甲霜靈;試紙條;快速檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：TS207.5? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）02-0107-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.024? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

中國(guó)煙草（Nicotiana tabacum L.）種植歷史悠久，煙草需求量隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展也越來(lái)越大。煙草在種植過(guò)程中常出現(xiàn)黑脛病、青枯病、根腐病等[1-3]，施藥后農(nóng)藥殘留情況不可避免。因此，煙草農(nóng)藥殘留安全問(wèn)題成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

甲霜靈屬N-苯基酰胺類(lèi)高效內(nèi)吸性殺菌劑化合物，對(duì)由真菌引起的黑脛病具有特異殺菌效果[4]。中國(guó)在農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了農(nóng)藥甲霜靈在黃瓜、葡萄等瓜果蔬菜的最大殘留限量分別為0.5、1.0 mg/kg[5]。而在煙草行業(yè)，由中國(guó)煙草總公司制定的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，規(guī)定了甲霜靈的最大殘留限量為2.0 mg/kg[6]。

國(guó)內(nèi)目前測(cè)定甲霜靈殘留的方法多采用色譜法[7，8]，該方法不僅需要購(gòu)買(mǎi)昂貴的色譜儀，而且需要專(zhuān)業(yè)人員來(lái)檢測(cè)，不適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及推廣應(yīng)用。貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司結(jié)合市場(chǎng)需求及農(nóng)藥殘留檢測(cè)現(xiàn)狀，采用膠體金免疫技術(shù)研制出甲霜靈殘留檢測(cè)試紙條，具有高效、快速、低成本等特點(diǎn)，旨在為實(shí)現(xiàn)煙草中甲霜靈殘留的快速檢測(cè)提供一種檢測(cè)手段。

1? 材料與方法

1.1? 材料

Balb/c小鼠（北京勤邦生物技術(shù)有限公司），甲霜靈、苯霜靈、惡霉靈、多菌靈、三唑酮、吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥99.0%），煙草（購(gòu)自貴州省畢節(jié)、遵義、黔西南等地），弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白、氯金酸、氯甲酸異丁酯（Sigma公司），檸檬酸三鈉、檸檬酸鈉、碳酸鉀、甲醇等（國(guó)藥集團(tuán)），背板、硝酸纖維素膜、無(wú)紡布、金標(biāo)墊、吸水紙（上海金標(biāo)生物科技有限公司）。

HGS201型切條機(jī)、BioDot-XYZ3060型三維噴點(diǎn)平臺(tái)、GL-21M高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司），90-2型磁力攪拌器（上海振榮科學(xué)儀器有限公司）、DHP-600S電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2? 方法

1.2.1? 抗原合成? 將甲霜靈原料溶于75%甲醇溶液，加入氫氧化鋰30 ℃反應(yīng)過(guò)夜，減壓蒸餾冷卻凝固得白色固體即為甲霜靈半抗原[9]，合成路徑。稱(chēng)取適量甲霜靈半抗原溶于DMF，加100 μL氯甲酸異丁酯攪拌反應(yīng)30 min后加入牛血清白蛋白緩沖液，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜即得甲霜靈抗原[10，11]。

1.2.2? 單克隆抗體制備? 將合成的甲霜靈抗原與弗氏佐劑混合按50 μg/只注入Balb/c小鼠皮下，使其產(chǎn)生多克隆抗體。免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株[10-12]。Balb/c小鼠腹腔注射滅菌石蠟油7 d后，注射雜交瘤細(xì)胞株采集腹水，腹水經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法純化，抗體濃度標(biāo)定至10 μg/mL。

1.2.3? 膠體金的制備? 去離子水將氯金酸稀釋至0.02%，置磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，每100 mL氯金酸加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，液體呈紅色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水[13-15]。

1.2.4? 試紙條最佳條件篩選? 0.1 mol/L碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至6.8，設(shè)定甲霜靈抗體終濃度梯度為5、10、15、20、25、30 ng/mL，混勻靜置30 min后加入10%氯化鈉溶液[16]，篩選最佳抗體濃度。

0.1 mol/L碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至梯度5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，依次加入最佳抗體量，混勻靜置30 min后加入10%氯化鈉溶液，篩選最佳pH。

1.2.5? 試紙條的制備? 0.1 mol/L碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至最佳值，甲霜靈抗體終濃度最佳，混勻靜置30 min后加入BSA至終濃度為2%，混勻靜置30 min后4 ℃下12 000 r/min離心30 min，棄去上清液，緩沖液將沉淀重懸，重懸沉淀即為抗體-膠體金標(biāo)記物?？贵w-膠體金標(biāo)記物經(jīng)BioDot-XYZ3060三維噴點(diǎn)平臺(tái)噴點(diǎn)到PB處理的金標(biāo)墊上，恒溫烘箱烘干。

0.02 mol/L PB分別將合成的甲霜靈抗原和羊抗鼠抗體稀釋?zhuān)瑖婞c(diǎn)到硝酸纖維素膜上，構(gòu)成T區(qū)和C區(qū)。將PB處理的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在背板上，切成4 mm寬試紙條。

1.2.6? 檢測(cè)方法及結(jié)果判讀? 取1 g煙葉剪成碎片，用5 mL甲醇浸滿(mǎn)樣品，振蕩1 min，靜置后移取0.15 mL混入1 mL PB稀釋液。從包裝袋取出試紙條，取3～4滴稀釋液滴加于樣孔中，反應(yīng)5～10 min，判讀結(jié)果。當(dāng)質(zhì)控區(qū)（C區(qū)）顯示出紅色條帶，檢測(cè)區(qū)（T區(qū)）不顯色，判為陽(yáng)性;當(dāng)C區(qū)顯示出紅色條帶，T區(qū)顯示出紅色條帶，判為陰性;當(dāng)C區(qū)不顯示出紅色條帶，該試紙條判為無(wú)效。

1.2.7? 試紙條試驗(yàn)? 陰性干、鮮煙葉添加甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品至濃度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/kg進(jìn)行樣品檢測(cè)，確定試紙條靈敏度。陰性干、鮮煙葉添加苯霜靈、多菌靈、三唑酮、吡蟲(chóng)啉至濃度5、10、20、50 mg/kg進(jìn)行樣品檢測(cè)，判斷試紙條特異性。

將采集自貴州各地的干煙葉27份、鮮煙葉23份分別進(jìn)行試紙條檢測(cè)和色譜檢測(cè)[17]。試紙條檢測(cè)結(jié)果判讀陰性標(biāo)記為“-”，陽(yáng)性標(biāo)記為“+”。色譜檢測(cè)方法未檢出的標(biāo)記為“-”，其他以實(shí)際結(jié)果標(biāo)識(shí)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 最佳抗體濃度

甲霜靈單克隆抗體篩選最佳抗體濃度結(jié)果。在5、10、15、20、25、30 ng/mL 6個(gè)梯度中，加入氯化鈉后甲霜靈抗體終濃度為5和10 ng/mL時(shí)灰黑色較明顯并遞減，終濃度20 ng/mL后與15 ng/mL相比較，膠體金溶液顏色透亮，膠體金性質(zhì)穩(wěn)定。綜合考慮抗體用量及與膠體金結(jié)合情況，選擇終濃度20 ng/mL為甲霜靈單克隆抗體標(biāo)記濃度。

2.2? 最佳pH

以0.1 mol/L碳酸鉀分別調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，依次加入甲霜靈單克隆抗體至終濃度20 ng/mL，混勻靜置30 min后加入10%氯化鈉溶液，試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示pH在6.5、7.0時(shí)所得膠體金溶液性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)灰黑色沉淀。因此，反應(yīng)最佳pH范圍為6.5～7.0。

2.3? 試紙條靈敏度

試紙條分別檢測(cè)添加甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/kg的干、鮮煙葉。干煙葉樣品中甲霜靈濃度為0.5、1.0 mg/kg時(shí)，試紙條結(jié)果呈陰性（-）;干煙葉樣品中甲霜靈濃度分別為1.5、2.0、2.5 mg/kg時(shí)，試紙條結(jié)果呈陽(yáng)性（+），檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1?？s小甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品濃度添加為1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mg/kg的干煙葉檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，當(dāng)檢測(cè)濃度為1.1、1.2、1.3、1.4 mg/kg的干煙葉樣品時(shí)，試紙條結(jié)果仍呈陰性;當(dāng)檢測(cè)濃度為1.5 mg/kg的干煙葉樣品時(shí)，試紙條結(jié)果呈陽(yáng)性。因此，該試紙條對(duì)干煙葉甲霜靈檢測(cè)限為1.5 mg/kg。

鮮煙葉靈敏度檢測(cè)結(jié)果如表3、表4所示，分析結(jié)果可知，該試紙條對(duì)鮮煙葉甲霜靈檢測(cè)限為1.0 mg/kg。

2.4? 試紙條特異性

分別檢測(cè)向陰性干、鮮煙葉添加苯霜靈、惡霉靈、多菌靈、三唑酮、吡蟲(chóng)啉至濃度為5、10、20、50 mg/kg，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5，陰性標(biāo)記為“-”，陽(yáng)性標(biāo)記為“+”。其中，苯霜靈是甲霜靈結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，惡霉靈常與甲霜靈混合使用，其他3種為煙草常用藥物。試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示5種藥物均為陰性，即與其他藥物無(wú)交叉反應(yīng)，試紙條特異性強(qiáng)。

2.5? 煙草檢測(cè)

采集自貴州畢節(jié)、遵義等各地干煙葉27份、鮮煙葉23份，共計(jì)50份，干煙葉依次編號(hào)1-27，鮮煙葉依次編號(hào)28-50。分別以試紙條方法和色譜方法檢測(cè)，甲霜靈試紙條干煙葉檢測(cè)限為1.5 mg/kg，鮮煙葉為1.0 mg/kg。試紙條檢測(cè)結(jié)果判讀陰性標(biāo)記為“-”，陽(yáng)性標(biāo)記為“+”。色譜檢測(cè)方法，未檢出的標(biāo)記為“-”，其他以實(shí)際結(jié)果標(biāo)識(shí)，結(jié)果如表6所示。由表6可知，試紙條檢測(cè)與氣相色譜儀檢測(cè)煙葉中甲霜靈殘留符合率高達(dá)98%，假陽(yáng)性率2.3%。說(shuō)明甲霜靈殘留快速檢測(cè)試紙條能對(duì)煙草中甲霜靈定性檢測(cè)，但不能完全排除假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果可以進(jìn)行復(fù)檢及氣相色譜等方法進(jìn)行確定。

3? 結(jié)論

甲霜靈殘留快速檢測(cè)試紙條基于免疫膠體金技術(shù)，以膠體金作為抗原抗體免疫反應(yīng)的示蹤標(biāo)志物[15]。半抗原的合成由甲霜靈原料一步反應(yīng)完成，合成工藝簡(jiǎn)單，對(duì)物質(zhì)本身的改造較少，半抗原制備抗原后經(jīng)免疫能夠獲得特異性較強(qiáng)的抗體。膠體金顆粒采用檸檬酸三鈉還原氯酸金，再與甲霜靈單克隆抗體復(fù)合得到Ab-膠體金標(biāo)記物。標(biāo)記試驗(yàn)中優(yōu)化了甲霜靈單克隆抗體標(biāo)記量及膠體金溶液pH環(huán)境，得到最佳的甲霜靈單克隆抗體標(biāo)記量為20 ng/mL，最佳金溶液pH為6.5～7.0，并建立了甲霜靈單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物制備方案。

本研究中試紙條與甲霜靈類(lèi)似物苯霜靈、惡霉靈及煙草常用藥物（多菌靈、三唑酮、吡蟲(chóng)啉）之間無(wú)交叉反應(yīng)，試紙條檢出限為干煙葉1.5 mg/kg，鮮煙葉1.0 mg/kg。樣品檢測(cè)結(jié)果與色譜法檢測(cè)結(jié)果相比符合率高達(dá)98%，說(shuō)明試紙條檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、可靠。使用本試紙條檢測(cè)煙草樣品與色譜法相比處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員、經(jīng)濟(jì)適用等特點(diǎn)，能夠?yàn)闊煵莠F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、抽查、管控提供便捷。

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