曹智，張晶晶，張志恒，王威，石菁，王朋寶，張金文

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅天億興種業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅 金昌 737205)

草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑，是目前世界上用量最大的除草劑[1]，其殺草機(jī)理是競(jìng)爭(zhēng)性抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EP SPs)的活性，使芳香族氨基酸合成受阻，從而使植株死亡[2].EPSPs主要定位在葉綠體中[3]，Rubisco葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(chloroplast transit peptide，CTP)可以將其定位到葉綠體中[4]，而細(xì)菌來(lái)源的EPSPs基因不含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽[5-6]，在植物中應(yīng)用須整合外源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽.盡管在1978年Rubisco小亞基前體轉(zhuǎn)運(yùn)肽就已經(jīng)被克隆，但到目前為止，被克隆且功能被確認(rèn)的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽并不多[7]，因此，Rubisco小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽對(duì)培育抗草甘膦作物品種有著重要的意義.

眾所周知，磷是作物生長(zhǎng)所必需的大量元素之一，是提高作物產(chǎn)量、保持品種優(yōu)良特性的重要元素[8].在我國(guó)約有2/3的耕地缺磷[9]，特別是北方土壤偏堿性，許多土壤中的磷素呈固定態(tài)，難以被植物吸收利用，為此在作物生長(zhǎng)期間需要施用大量的磷肥.但研究表明，磷肥施入土壤后，能很快地被吸附到土壤顆粒表面或與土壤一些物質(zhì)(Fe2+、Al3+、Ca2+)等生成難溶的磷酸鹽[10]，從而影響磷肥利用率，只有不到20%的磷肥能被當(dāng)季的作物利用[11].植酸酶即肌醇六磷酸水解酶，是一種磷酸酯酶，可以特異地催化植酸及將植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)[12].一些植物在缺磷脅迫條件下可通過(guò)分泌大量植酸酶來(lái)有效利用土壤中的有機(jī)磷[13]，研究人員已將植酸酶基因成功導(dǎo)入植物(煙草[14]、擬南芥[15]、油菜[16]、玉米[17]、水稻[18]等)，轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)的植酸酶可在信號(hào)肽引導(dǎo)下分泌到根外，可分解植酸態(tài)磷供其利用，增強(qiáng)對(duì)土壤中磷素的利用.

在玉米的轉(zhuǎn)基因研究中，人們已經(jīng)成功獲得了具有抗蟲(chóng)[19]、抗病[20]、抗非生物逆境[21]以及抗除草劑[22]等種質(zhì)，抗除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米品種更是被廣泛種植.現(xiàn)如今轉(zhuǎn)基因研究的重點(diǎn)已逐漸轉(zhuǎn)向了抗逆與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)兼有的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物研究上，并取得了階段性成果[23].如果通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將來(lái)源于微生物的抗草甘膦基因和植酸酶基因?qū)胗衩字?，使其具備草甘膦抗性并且能在根系中高效表達(dá)植酸酶，促進(jìn)根系對(duì)有機(jī)態(tài)磷的利用，更加有效地吸收利用磷資源，將會(huì)大大節(jié)約磷肥，降低玉米生產(chǎn)成本，提高玉米產(chǎn)量.

本研究構(gòu)建由Ubiquitin1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的含有兩種葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的CP4EPSPs基因和根部特異性啟動(dòng)子GLU1P驅(qū)動(dòng)的植酸酶基因phyA2的植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米，以期為培育磷高效吸收且具有草甘膦抗性的優(yōu)良復(fù)合性狀玉米品種打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米種質(zhì)材料選用‘TY7-2’和‘TY4CV’，由甘肅天億興種業(yè)有限責(zé)任公司提供.其中，‘TY7-2’是從國(guó)內(nèi)著名品種‘鄭單958’的父本‘昌7-2’中選出的突變自交系，‘TY4CV’是從‘先玉335’父本‘PH4CV’中選出的穩(wěn)定自交系，其穗軸為紅色.

大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、根癌農(nóng)桿菌EHA105(AgrobacteriumtumefaciensEHA105)、植物表達(dá)載體pCEPSPS(pCMBIA1300的衍生載體，將原載體中的潮霉素抗性基因(hyg)替換為草甘膦抗性基因(epsps)) 和質(zhì)粒pMDnos(含NOS終止子)，均由甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地提供， pTOPO-EPSPS(含EPSPs基因)由甘肅省農(nóng)科院張建平研究員惠贈(zèng)，植酸酶基因phyA2由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所陳茹梅研究員惠贈(zèng).pMD19-T Easy Vector、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR試劑，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物合成及DNA序列測(cè)定由金唯智生物科技(蘇州)有限公司完成；植物RNA 提取Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen；QuantScript RT Kit cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司.其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)對(duì)EPSPs N端氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，選擇了葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列為CC基因序列(ID:X06535)，序列長(zhǎng)222 bp，編碼74個(gè)氨基酸.根據(jù)載體pCE-NGC3(圖1)和pCE-NGM3(圖2)構(gòu)建的酶切位點(diǎn)，并參照EPSPs基因序列(美國(guó)Monsanto公司專利：US5633435)、CM基因序列(美國(guó)Monsanto公司專利：US0056 33435A)、Ubiquitin啟動(dòng)子序列(ID：DQ141598.1)、根部特異性啟動(dòng)子(GLU1P)基因序列(ID：DQ333310.1)、植酸酶(phyA2)基因序列(ID:EU786167.1)、NOS終止子基因序列(ID:AF485783)，采用Oligo7軟件設(shè)計(jì)PCR引物(表1)，提交蘇州金唯智生物科技有限公司合成.

表1 目的基因的PCR擴(kuò)增引物

下劃線部分為酶切位點(diǎn)，黑體部分為重疊堿基.

The underline representatives restriction sites,the bold type representatives overlapping nucleotide.

1.3 玉米轉(zhuǎn)運(yùn)肽的檢索與生物信息學(xué)分析

從GenBank(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索玉米R(shí)ubisco小亞基(rbcS)序列(ID:100279574)，通過(guò)CBS Predition servers(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/)中的和ChloroP 1.1預(yù)測(cè)rbcS的亞細(xì)胞定位及預(yù)測(cè)其剪切位點(diǎn).

1.4 目的片段的克隆和合成

以玉米cDNA為模板，用特異引物C1/C2擴(kuò)增選擇的玉米rbcS轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CC)片段；以質(zhì)粒TOPO-EPSPs基因?yàn)槟０妫锰禺愐顴1/E2擴(kuò)增EPSPs基因；CM基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；采用重疊延伸PCR技術(shù)[25]，將轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CC)片段與EPSPs基因、CM片段與EPSPs基因融合，分別回收目的片段后，連接到pMD19-T載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的命名為pMD-CEPSPS和pMD-MEPSPS.

以玉米基因組DNA為模版，用特異引物U1/U2、G1/G2分別擴(kuò)增Ubiquitin啟動(dòng)子和根特異性GLU1P啟動(dòng)子，分別回收目的片段，與pMD-19T載體連接并測(cè)序，測(cè)序正確的命名為pMD-UBI和pMD-GLU1P.

以pMDnos質(zhì)粒為模版，用特異性引物N1/N2擴(kuò)增NOS終止子；以pGA1611EAO質(zhì)粒為模版，用特異性引物P1/P2擴(kuò)增植酸酶基因(phyA2)，分別回收目的片段與pMD-19T載體連接并測(cè)序，將其命名為pMD-NOS和pMD-phyA2.

1.5 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)雙酶切[26]和In-Fusion同源重組方法[27]，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCE-NGC3和pCE-NGM3.用PstⅠ和HindⅢ酶切pMD-NOS和pCEPSPS，回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接，獲得載體pCE-N； 然后用SacⅠ和XmaⅠ分別酶切pMD-GLU和pCE-N，回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接，獲得重組子pCE-NG； 再用EcoRⅠ和XhoⅠ分別酶切pMD-CEPSPS、pMD-MEPSPS和pCE-NG，回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接，獲得重組子pCE-NGC和pCE-NGM； 再用EcorRⅠ和SacⅠ分別酶切pMD-UBI、pCE-NGC和pCE-NGM，回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接，獲得重組子pCE-NGC2和pCE-NGM2； 最后用XmaⅠ分別酶切pCE-NGC2和pCE-NGM2，用In-Fusion無(wú)縫連接技術(shù)將phyA2基因連入，獲得重組子pCE-NGC3和pCE-NGM3.

圖1 pCE-NGC3表達(dá)載體結(jié)構(gòu)Figure 1 Chematic diagram of pCE-NGC3 expressing vector structure

圖2 pCE-NGM3表達(dá)載體結(jié)構(gòu)Figure 2 Chematic diagram of pCE-NGM3 expressing vector structure

采用CaCl2凍融法[28]分別將2種重組植物表達(dá)載體pCE-NGC3和pCE-NGM3導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA 105感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均勻涂布于含卡那霉素和利福平的YEP固體培養(yǎng)基，28 ℃暗培養(yǎng)28～30 h，挑取單菌落接種到含上述抗生素的YEP液體培養(yǎng)基，28 ℃震蕩培養(yǎng)28 h 左右，提取質(zhì)粒，用特異性引物U1/U2進(jìn)行PCR鑒定，并保存農(nóng)桿菌工程菌用于植物轉(zhuǎn)化.

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化及鑒定

挑選飽滿的玉米自交系種子，用70%的乙醇浸泡8 min，然后用0.1%的升汞浸泡6 min，再用無(wú)菌水沖洗4次，然后用無(wú)菌水室溫浸泡4～6 h，再用升汞消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5次，28 ℃黑暗條件下萌發(fā).發(fā)芽后轉(zhuǎn)到萌發(fā)培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，待苗長(zhǎng)至4 cm高時(shí)，剝?nèi)ヅ哐壳屎陀兹~，暴露出莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，用解剖針輕刺生長(zhǎng)點(diǎn)，將莖尖浸泡在重懸液中，并在50 kPa壓力下侵染7 min，用無(wú)菌濾紙吸凈多余的菌液，置于萌發(fā)培養(yǎng)基上，28 ℃暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至重新長(zhǎng)出新葉片.將長(zhǎng)出新葉片的幼苗用清水洗掉菌體，移栽到花盆中，2～3周后苗長(zhǎng)至三葉期，用0.15%的草甘膦(農(nóng)達(dá))噴灑在葉片上進(jìn)行篩選，將存活的植株移栽到溫室，開(kāi)花期套袋自交.收獲的種子播種，提取基因組DNA作模板，以野生型植株基因組DNA作陰性對(duì)照，用引物E1/E2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)化植株預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 368 bp.

1.7 目的基因表達(dá)水平分析

轉(zhuǎn)化的目的基因表達(dá)分析采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)[29].根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)檢測(cè)EPSPs的引物(上游引物：TTGGTTGCTGCCTTGCTTGT，下游：ATGTCGGCACCCATTTCCTG)，內(nèi)參為玉米Actin基因(上游引物：ATCACCATTGGGTCAGAA AGG，下游引物：GTGCTGAGAGAAGCCAAA ATAGAG).用植物總RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的葉片總RNA，用QuantScript RT Kit cDNA試劑盒合成cDNA 第一鏈，采用SYBRR Premix ExTaqTMII實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行定量分析.反應(yīng)體系為(20 μL)： SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 7.2 μL.

1.8 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)草甘膦的反應(yīng)

在2種表達(dá)載體(pCE-NGC3和pCE-NGM3)轉(zhuǎn)化的玉米植株長(zhǎng)至4～5片葉時(shí)，分別噴施0.3%、0.45%、0.6%、0.75% 4個(gè)濃度梯度的草甘膦溶液， 10 d后觀察植株的受損程度及恢復(fù)情況.

1.9 植酸酶活性測(cè)定

采用丙酮-磷鉬酸銨法[30]對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶的活性進(jìn)行測(cè)定.配置濃度為0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5和5 mmol/L磷酸二氫鉀溶液，各取2 mL加入編號(hào)的試管中，吸取2 mL蒸餾水做空白對(duì)照，每管分別加入8 mL顯色液(丙酮∶鉬酸銨∶硫酸=2∶1∶1)和1 mL的檸檬酸溶液，用力搖勻顯色5 min，在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值.以無(wú)機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.提取玉米根組織分泌植酸酶粗提液，采用相同的方法測(cè)定D420值，然后按下列公式計(jì)算酶活力.

式中，50為反應(yīng)液中酶液的稀釋倍數(shù)；N為溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；P為反應(yīng)液中總磷的濃度減去反應(yīng)中底磷的濃度(對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線查得)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；W為根系樣品質(zhì)量(g).

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽生物信息學(xué)分析結(jié)果

利用TargetP1.1和ChloroP1.1預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)170 aa的rbcS序列中含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，切割位點(diǎn)可能位于第46個(gè)殘基附近(表2).在此基礎(chǔ)上確定rbcS的N端74個(gè)aa的編碼序列為候選片段，堿基長(zhǎng)度共222 bp，將其命名為CC.

表2 TargetP和ChloroP預(yù)測(cè)分析結(jié)果

2.2 目的基因的克隆

以玉米cDNA為模版，用引物C1/C2擴(kuò)增編碼rbcS轉(zhuǎn)運(yùn)肽的片段(CC)；以質(zhì)粒TOPO-EPSPs基因?yàn)槟０?，用引物E1/E2擴(kuò)增EPSPs基因；參照Barry 等[24]CTP序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成CM片段；采用重疊延伸PCR技術(shù)(splicing-by-overlap extension PCR，SOE-PCR)，分別將CC、CM片段與EPSPs基因融合，得到1 605 bp和1 603 bp的融合基因(圖3)，與克隆載體pMD19-T連接，酶切鑒定后測(cè)序，同源性達(dá)到了99%和99%.

以玉米基因組DNA為模版，用引物U1/U2、G1/G2分別擴(kuò)增Ubiquitin啟動(dòng)子和GLU1P根部特異性啟動(dòng)子，得到1 992 bp和1 846 bp特異片段(圖3)，分別與克隆載體pMD19-T連接，酶切鑒定后測(cè)序，同源性達(dá)到98%和99%.

以pMDnos質(zhì)粒為模版，用特異性引物N1/N2擴(kuò)增NOS終止子；以PGA1611EAO質(zhì)粒為模版，用特異性引物Z1/Z2擴(kuò)增phyA2基因，得到253 bp和1 347 bp特異性條帶(圖3)，分別與克隆載體pMD19-T連接，酶切鑒定后測(cè)序，同源性達(dá)到了100%和98%.

1：CEPSPS;2：MEPSPS；3：Ubi；4：GLU1P；5：NOS；6：phyA2.圖3 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 3 Agarose gel electrophoresis to identify the PCR products

2.3 植物表達(dá)載體pCE-NGC3和pCE-NGM3的構(gòu)建及檢測(cè)

酶切和測(cè)序結(jié)果均證明成功構(gòu)建了pCE-NGC3和pCE-NGM3載體，分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞.提取質(zhì)粒，用引物U1/U2進(jìn)行PCR鑒定，目標(biāo)條帶大小與預(yù)期一致，證明目標(biāo)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌.

2.4 轉(zhuǎn)化再生苗的獲得及檢測(cè)

將轉(zhuǎn)化苗用清水洗掉菌體，移栽到花盆中，2周后長(zhǎng)至三葉期，經(jīng)過(guò)0.15%的除草劑篩選后，共有23株幼苗存活(圖4).提取抗性植株葉片的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，其中9株檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性(圖5)，初步說(shuō)明外源基因已整合到9株轉(zhuǎn)化植的基因組中，其中‘TY7-2’4株(轉(zhuǎn)CEPSP基因2株、轉(zhuǎn)MEPSP基因2株)、‘TY4CV’5株(轉(zhuǎn)CEPSP基因2株、轉(zhuǎn)MEPSP基因3株).

2.5 EPSPs基因在轉(zhuǎn)基因植株葉片中的表達(dá)水平

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6)，與野生型植株(CK)相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片中EPSPs基因的表達(dá)量明顯提高，但不同轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)量存在一定的差異，這種差異不但在兩種載體轉(zhuǎn)化植株間存在，而且在同一轉(zhuǎn)化載體的不同轉(zhuǎn)化品種間也存在.總體上來(lái)看，在轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株中，玉米葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CC)與EPSPs融合的基因(CEPSP)要比Barry 等[24]報(bào)道的融合轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CM)基因的表達(dá)量平均提高了31%.由此說(shuō)明，不同葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽對(duì)外源基因在葉片的表達(dá)量有一定的影響.

A：種子萌發(fā)；B：侵染前的莖尖；C：侵染；D：共培養(yǎng)；E：移栽成苗；F：篩選.A:seed germination;B:The stem apex before infection；C:Infection；D:co-culture；E:The seedlings were transplanted；F:The resistant seedlings after herbicide selection.圖4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化Figure 4 Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of maize shoot apical meristem

2.6 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)草甘膦抗性的比較

在轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)至4～5片葉時(shí)，分別噴施0.3%、0.45%、0.6%、0.75% 4個(gè)濃度梯度的草甘膦溶液，10 d后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株的受損程度及恢復(fù)情況.隨著噴灑濃度的增加，植株存活率下降(表3)，在噴灑0.6%的草甘膦后，兩種載體轉(zhuǎn)化的植株都出現(xiàn)葉尖發(fā)黃干枯，但轉(zhuǎn)MEPSP植株葉片萎蔫早且受損嚴(yán)重，開(kāi)始表現(xiàn)出葉尖及下部葉片變黃，葉色變深發(fā)褐、植株逐漸萎蔫、最終絕大多數(shù)死亡，少量存活植株也表現(xiàn)出生長(zhǎng)停滯和畸形，而轉(zhuǎn)CEPSP植株的葉片受損程度輕且癥狀不明顯，植株表現(xiàn)出更好的抗性，仍能正常生長(zhǎng)存活.

N:野生型植株；1～7：轉(zhuǎn)化植株.N:Untransformed plant;1～7:Transgenic plants.圖5 部分玉米轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)Figure 5 PCR detection of partially transformed regenerated plants

2.7 轉(zhuǎn)基因植株根系植酸酶基因表達(dá)及活性分析

以無(wú)機(jī)磷的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸方程為Y=0.19X+0.017 7，R2=0.999 6，R>0.99，說(shuō)明該曲線有比較準(zhǔn)確的線性關(guān)系.

由圖7可知，轉(zhuǎn)基因植株的植酸酶酶活力有很明顯的提高，相比于CK植株，轉(zhuǎn)化植株的植酸酶酶活力提高15.9～23.8倍，平均提高18.7倍.從而證明植酸酶基因已在轉(zhuǎn)基因植株根部表達(dá)，并分泌能降解植酸鹽的植酸酶.

圖6 不同轉(zhuǎn)化株系中葉片EPSPS基因的相對(duì)表達(dá)量Figure 6 Relative expression of EPSPS gene in leaves of different transformed lines

草甘膦濃度/%Glyphosate concentration轉(zhuǎn)MEPSP基因植株Transfer of MEPSP gene轉(zhuǎn)CEPSP基因植株Transfer of CEPSP gene0.30正常生長(zhǎng)正常生長(zhǎng)0.45葉片局部變黃,數(shù)量極少正常生長(zhǎng)0.60葉片片狀干枯并向內(nèi)卷曲,生長(zhǎng)受到抑制葉尖、葉緣黃枯,其他部位良好0.75植株生長(zhǎng)停滯,萎蔫死亡部分植株呈全株性萎蔫,葉片變褐,緩慢枯死

圖7 不同植株根部的植酸酶活性分析Figure 7 Phytase activity analysis of different plant roots

3 討論

隨著世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)向著機(jī)械化和集約化方向發(fā)展，抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物已成為一種普遍的種植需求.草甘膦抗性成為作物重要的農(nóng)藝性狀，從上世紀(jì)80年代，人們便開(kāi)始尋找具有草甘膦抗性的EPSPs基因[31].EPSPs基因主要定位在葉綠體中[3]，而具有草甘膦抗性的EPSPs基因大多來(lái)源于細(xì)菌，需要在其5’端整合可以將外源蛋白定位到葉綠體中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽[32]，不同植物中同一種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽雖具有相似的定位功能，但序列無(wú)明顯的保守性[33]，選擇合適的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽很可能提高轉(zhuǎn)基因植物蛋白的表達(dá)量.本研究利用TargetP和ChloroP軟件分析挑選玉米葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，構(gòu)建pCE-NGC3和pCE-NGM3載體，使用農(nóng)桿菌EHA105對(duì)玉米莖尖進(jìn)行侵染，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株.RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，pCE-NGC3載體轉(zhuǎn)化植株比pCE-NGM3載體轉(zhuǎn)化植株的基因表達(dá)量平均提高了31%.可見(jiàn)該轉(zhuǎn)運(yùn)肽不僅具有將外源基因定位到葉綠體中的功能，還能提高外源基因的表達(dá).葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽能提高轉(zhuǎn)基因植株中外源基因表達(dá)的原因可能是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列讓外源基因的mRNA更穩(wěn)定.比如DeAlmeida等[34]發(fā)現(xiàn)編碼新霉素轉(zhuǎn)磷酸酶Ⅱ和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的外源基因在整合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽后在轉(zhuǎn)基因植物的葉片中具有更高的mRNA穩(wěn)定性.

轉(zhuǎn)基因作物能否承受大劑量的除草劑，這是抗除草劑作物能否在田間應(yīng)用的重要指標(biāo).Castle 等[35]將改造優(yōu)化后的GAT轉(zhuǎn)入玉米后，獲得了具有6倍劑量草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因玉米植株.余桂容等[36]將含有2 個(gè)耐草甘膦基因(2mG2-epsps和R79-epsps)的雙價(jià)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米中，獲得的轉(zhuǎn)基因玉米最高可耐受0.6%的草甘膦濃度，相當(dāng)于田間使用濃度的3倍.本研究利用高濃度草甘膦噴灑轉(zhuǎn)基因玉米植株，發(fā)現(xiàn)0.6%的除草劑濃度會(huì)使轉(zhuǎn)基因玉米植株受到傷害，但受損的程度輕且癥狀不明顯.因此，通過(guò)優(yōu)化葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽對(duì)提高草甘膦抗性也有重要的實(shí)際意義.

1907年開(kāi)始，Suzuki等[30]人首次在米糠中發(fā)現(xiàn)了植酸酶，并發(fā)現(xiàn)植酸酶有超強(qiáng)的降解植酸的能力，從此對(duì)植酸酶就進(jìn)行深入而廣泛的研究.迄今為止，100多年來(lái)已經(jīng)從真菌、細(xì)菌以及植物中分離和鑒定了多個(gè)植酸酶基因.本研究將從黑曲霉中分離的phyA2基因在玉米根部特異性啟動(dòng)子ZmGLU1P的驅(qū)動(dòng)下導(dǎo)入玉米中，獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株，使植酸酶基因能夠在轉(zhuǎn)基因植株根部表達(dá)并分泌植酸酶.通過(guò)對(duì)根部植酸酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中植酸酶活性相比野生型植株平均提高18.7倍.表明根組織蛋白提取液中含有植酸酶成分，對(duì)植酸鈉具有降解作用，這與劉強(qiáng)等[37]的研究結(jié)果一致.Richardson等[15]將植酸酶基因?qū)霐M南芥，通過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥分泌的外源植酸酶是提高土壤磷素利用率的主要因素.植物對(duì)土壤中植酸鹽的利用主要是依靠根分泌植酸酶的能力，因此對(duì)根分泌的植酸酶能力和田間相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究分析，創(chuàng)造高效磷吸收的玉米新種質(zhì)將是本課題組進(jìn)一步研究的方向.

本研究將草甘膦抗性基因和植酸酶基因一同轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系，賦予了植株抗除草劑草甘膦的特性，同時(shí)提高了植株對(duì)磷素的吸收利用效率，改善了玉米的生長(zhǎng)狀態(tài)，為培育磷高效吸收且具有草甘膦抗性的優(yōu)良復(fù)合性狀玉米品種具有重要的理論指導(dǎo)意義.