段衛(wèi)朋，馬騰臻，李蔚，趙婉珍，周繼亙，韓舜愈

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

葡萄酒香氣是評判葡萄酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，決定著葡萄酒的風(fēng)味和典型性[1].已經(jīng)報(bào)道的香氣物質(zhì)有1300多種，主要包括酯、醇、酸、萜烯等.葡萄酒的風(fēng)味受葡萄品種、釀造工藝、產(chǎn)地氣候條件和土壤等因素的影響[2].我國西部產(chǎn)區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒存在果香不足，香氣細(xì)膩度、優(yōu)雅度缺乏以及顏色穩(wěn)定性差的問題[3].新釀造的葡萄酒口感欠佳，需要一定時(shí)間經(jīng)過各種生理生化反應(yīng)才能使香氣達(dá)到最佳，從而改善酒的風(fēng)味.但陳釀過程往往耗時(shí)過長，增加了生產(chǎn)成本[4]，因此急需一種加工技術(shù)解決以上問題.

超高壓均質(zhì)技術(shù)(ultra-high pressure homogenization，UHPH)，也稱為動(dòng)態(tài)高壓，均質(zhì)壓力一般為60 MPa以上[5].UHPH處理過程中，流體通過均質(zhì)閥中狹窄的可調(diào)間隙獲得高壓、高速，產(chǎn)生壓力梯度、剪切力、高速碰撞、空穴效應(yīng).UHPH是一種非熱力加工技術(shù)，可以有效降低熱加工過程中熱效應(yīng)對食品的影響，避免了營養(yǎng)物質(zhì)的流失，特別適合流體食品的連續(xù)加工[6-7].近年來，有關(guān)UHPH技術(shù)的研究主要集中在果蔬汁和乳制品的殺菌、鈍酶及保持穩(wěn)定性方面.Crue[8]利用超高壓均質(zhì)技術(shù)在200和300 MPa下處理豆?jié){，細(xì)化了豆?jié){的顆粒，使豆?jié){更穩(wěn)定，也改變了豆?jié){的顏色，表觀粘度.潘見等[9]發(fā)現(xiàn)西瓜汁經(jīng)超高壓均質(zhì)處理后，隨均質(zhì)次數(shù)的增多，綜合感官評價(jià)不斷下降，多次均質(zhì)有可能破壞果汁的原有風(fēng)味.梁茂雨等[10]發(fā)現(xiàn)‘赤霞珠’葡萄酒經(jīng)超高壓處理后酯類物質(zhì)含量增加，風(fēng)味更柔和.冷慧娟等[11]研究表明，靜態(tài)超高壓處理‘赤霞珠’葡萄酒后，乙醇、雜醇油、總酸和醛類的含量有所減少，苯乙醇、總酯的含量有所增加，當(dāng)壓力達(dá)到500 MPa時(shí)，風(fēng)味變差.綜合前人研究，國內(nèi)由于機(jī)械設(shè)備及技術(shù)等客觀因素，幾乎所有研究報(bào)道均為靜態(tài)超高壓在葡萄酒上的應(yīng)用，而UHPH處理對葡萄酒品質(zhì)和香氣物質(zhì)的影響卻鮮有報(bào)道.

本試驗(yàn)為了解決西部產(chǎn)區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒果香不足，香氣細(xì)膩度、優(yōu)雅度缺乏以及自然陳釀熟化時(shí)間長這一問題，綜合前人對超高壓技術(shù)在葡萄酒上的研究，以河西產(chǎn)區(qū)的‘赤霞珠’葡萄酒為試驗(yàn)材料，分別經(jīng)UHPH不同壓力和循環(huán)次數(shù)處理，采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)檢測葡萄酒中香氣物質(zhì)的變化并進(jìn)行分析，為超高壓均質(zhì)技術(shù)在改善葡萄酒香氣方面應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘赤霞珠’干紅葡萄酒來自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒釀造實(shí)驗(yàn)室；2-辛醇(色譜純)購置于美國Sigma公司；無水乙醇、氯化鈉、偏重亞硫酸鉀、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、無水葡萄糖等均為國產(chǎn)分析級；費(fèi)林溶液、次甲基藍(lán)指示液、酚酞指示液、碘標(biāo)準(zhǔn)滴定液等按照國標(biāo)配制[12].

HPP.L3-600/0.6型超高壓處理設(shè)備(工作條件為100 MPa，6 L/h、200 MPa，4 L/h)：天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；CP214電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋：金壇市恒豐儀器制造有限公司；265079氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TG-WAX色譜柱：美國Thermo Scientific公司；頂空固相微萃取裝置、DVB/Carboxen/PDMS(50/30 μm)萃取器：美國Surpelco公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；18100摩爾超純水機(jī)：重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司；MSC-400磁力加熱攪拌器：德國Wiggen Hauser公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超高壓均質(zhì)處理 使用前用85 ℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%NaOH溶液、0.01%檸檬酸溶液及0.3%的偏重亞硫酸鈉溶液清洗，再用95 ℃以上的熱水循環(huán)30 min，對機(jī)器和管道進(jìn)行消毒.

待管道冷卻后，將酒樣灌入超高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)料口，進(jìn)行高壓均質(zhì)處理，壓力分別為100、200 MPa，每個(gè)酒樣分別在兩個(gè)壓力下循環(huán)處理1、2、3次得到6組不同處理?xiàng)l件，記為P100-1、P100-2、P100-3、P200-1、P200-2和P200-3，以不施加壓力為對照記為P0，共7組.每組3個(gè)平行,每個(gè)平行每次處理量為375 mL，處理后將酒樣灌裝至玻璃瓶中，于4 ℃冰箱中保存待測.

1.2.2 理化指標(biāo)測定 參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定總糖含量、總酸含量、酒精體積分?jǐn)?shù)、揮發(fā)酸含量等指標(biāo)[13].色度、色調(diào)、總花色苷、總酚含量測定參照翦祎等[14]報(bào)道的方法.

1.2.3 香氣成分分析

1.2.3.1 葡萄酒香氣成分提取 將5 mL葡萄酒放入20 mL萃取瓶，加入3 g NaCl和50 μL質(zhì)量濃度為1.64 mg/L的2-辛醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，密封好后置于40 ℃水浴，頂空萃取30 min后，GC-MS進(jìn)樣解吸10 min.

1.2.3.2 GC-MS分析 色譜條件：TG-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm，0.5 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初溫50 ℃保持5 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；載氣：高純He；分流比30∶1；流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣.

質(zhì)譜分析：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～450 m/z.

1.2.3.3 香氣成分的定性與定量 由GC-MS分析所得的樣品質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST、Wiley數(shù)據(jù)庫檢索比對及資料參考，進(jìn)行定性分析.各成分的含量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析.按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中，Xi為待測成分的質(zhì)量濃度(μg/L)；Cs為內(nèi)標(biāo)2-辛醇的質(zhì)量濃度(μg/L)；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai為待測物的峰面積.

1.2.3.4 香氣貢獻(xiàn)評價(jià) 各香氣物質(zhì)對葡萄酒整體香氣的的貢獻(xiàn)采用氣味活性值(odor activity value，OAV)進(jìn)行評價(jià).按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中，C為香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度(μg/L)；T為相應(yīng)的感官閾值(μg/L).一般認(rèn)為，OAV大于1的成分為樣品主體呈香化合物，OAV越大，對香氣的貢獻(xiàn)也就越大[16].

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)生物學(xué)平行，2次技術(shù)平行.數(shù)據(jù)采用 Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行處理，圖用OriginPro 9.0繪畫.

2 結(jié)果與討論

2.1 超高壓均質(zhì)處理對理化指標(biāo)的影響

‘赤霞珠’葡萄酒經(jīng)超高壓均質(zhì)處理后理化指標(biāo)的檢測結(jié)果如表1所示.與未處理組P0相比，處理后總酸含量有所下降，這可能是經(jīng)超高壓處理后，酯化反應(yīng)加劇，消耗了酸類物質(zhì)[10].揮發(fā)酸含量和酒精度在處理組與對照組間沒有發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的差異.與P0相比，處理后樣品色度、色調(diào)、總花色苷含量升高，這說明超高壓均質(zhì)處理并沒有對酒的顏色產(chǎn)生影響，相反地，酒的色澤變得更加深厚和飽滿的趨勢，這可能是超高壓均質(zhì)處理后，使花色苷降解的多酚氧化酶和糖苷水解酶的活力被抑制；另一方面，可能是超高壓均質(zhì)處理使聚合反應(yīng)加劇，形成了聚合花色苷[17-18].100 MPa處理后，隨著循環(huán)次數(shù)增加，花色苷的含量逐漸增加，200 MPa處理也出現(xiàn)相同的規(guī)律，但值得注意的是，P100-3組和P200-1組相比，與顏色相關(guān)的值相近.處理后總酚含量相比空白略有上升，但P200-3組的含量低于空白，這可能是一些酚酸發(fā)生了氧化反應(yīng)導(dǎo)致含量下降.

2.2 超高壓均質(zhì)處理對香氣成分的影響

由表2可知，對照組和處理組共測出香氣物質(zhì)82種，其中酯類25種，醇類30種，酸類14種，萜烯類6種，其他物質(zhì)7種.P0、P100-1、P100-2、P100-3、P200-1、P200-1、P200-3處理組分別測出69、63、64、67、68、68、70種香氣物質(zhì).新鮮干紅葡萄酒經(jīng)超高壓均質(zhì)處理后，其香氣物質(zhì)成分與含量均發(fā)生了變化.

表1 不同處理組赤霞珠干紅葡萄酒理化指標(biāo)

2.2.1 醇類化合物 醇類是酒精發(fā)酵主要產(chǎn)物之一，主要由糖代謝、氨基酸脫羧和脫氫產(chǎn)生，它能賦予葡萄酒特有的香氣[19].由表2可知，不同處理?xiàng)l件下醇總含量不同，隨著壓力的增大而逐漸減少，其中200 MPa循環(huán)1次的總量最低.本試驗(yàn)共檢測到醇類物質(zhì)30種，其中1-戊醇的含量最高，占醇類總量的50%以上 ，其次是苯乙醇、正己醇，這幾種醇為發(fā)酵過程的主要副產(chǎn)物，均為雜醇油，也是酒中容易讓人上頭的物質(zhì)，近幾年來眾多研究人員都是通過釀造工藝條件控制雜醇油的含量[20-22].在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超高壓處理后，苯乙醇與正己醇的含量減少，其中苯乙醇在200 MPa下均與對照組存在顯著性差異.1-戊醇的含量在100 MPa下與對照組相比

有所上升，在200 MPa下含量快速下降，與P0相比P200-1、P200-2、P200-3分別減少了28.1%、17.0%、23.3%，且差異顯著，其中P200-1下降最為顯著，這同醇類物質(zhì)總含量結(jié)果相同.同樣也表明在壓力一定的條件下，醇含量不隨循環(huán)次數(shù)的增加而減少.這一結(jié)果同冷慧娟等[11]報(bào)道一致.但嚴(yán)蕊等[23]發(fā)現(xiàn)靜態(tài)超高壓處理使黑莓酒中醇類物質(zhì)的含量增加，這可能是因?yàn)殪o態(tài)超高壓與瞬時(shí)動(dòng)態(tài)超高壓的工作原理不同.動(dòng)態(tài)瞬時(shí)超高壓處理使得新鮮‘赤霞珠’干紅葡萄酒中醇物質(zhì)降低可能是由于超高壓加快了雜醇油的反應(yīng)速度，使其與酸類發(fā)生了酯化反應(yīng)[24]，或者是促進(jìn)醇類物質(zhì)的氧化，使其轉(zhuǎn)化為醛或酸.

表2 不同處理組‘赤霞珠’干紅葡萄酒香氣成分及含量

“-”表示酒樣中未檢測到該種香氣成分；同一行標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05).

“-” indicates that the aroma component is not detected in the wine sample；Different letters in the same row means significant difference(P<0.05).

2.2.2 酯類化合物 酯類化合物可以賦予葡萄酒果香、花香等氣味，具有香味清，氣味爽，令人愉悅的特點(diǎn).一般酯類物質(zhì)主要來源于脂肪酸氧化、氨基酸代謝及醇和醛等代謝合成[25].本試驗(yàn)酒樣中共檢測到酯類物質(zhì)25種，其中辛酸乙酯的含量最高，其次為癸酸乙酯、乙酸乙酯.這幾種化合物都具有花香、果香.由表2可知，隨著壓強(qiáng)、循環(huán)次數(shù)的增加，酒中酯類物質(zhì)的含量依次升高.與對照組相比，P100-1、P100-2、P100-3、P200-1、P200-2、P200-3組酯類物質(zhì)總含量分別上升了9.6%、11.5%、32.3%、48.6%、55.0%、61.2%，且均與對照組存在顯著性差異，但200 MPa下酯類含量要比100 MPa升高更顯著，其中，P200-1、P200-2、P200-3相比對照組，辛酸乙酯的含量提高了3.7%、16.6%、23.8%，癸酸乙酯的含提高了28.7%、28.5%、16.8%，乙酸乙酯的含量分別提高了2.18、1.09、1.13倍，P200-2處理下這3種物質(zhì)含量都和對照組有顯著性差異.同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)辛酸、乙酸、癸酸等物質(zhì)含量都降低，這可能是由于經(jīng)過超高壓均質(zhì)處理后，酸和醇分子間發(fā)生了有效碰撞，加劇了酯化反應(yīng)[26]，從而酯類化合物含量升高.歸根結(jié)底在于葡萄酒的體積及分子間距由于壓力的增大而被壓縮減小.超高壓提供了外源能量，從而打破自然條件下葡萄酒中所有分子的平衡，使得分子重新排列，促進(jìn)締合反應(yīng)的進(jìn)行.

2.2.3 脂肪酸化合物 葡萄酒中的有機(jī)酸大部分為酒精發(fā)酵與蘋乳發(fā)酵的代謝副產(chǎn)物.研究表明，當(dāng)酸類物質(zhì)含量小于閾值時(shí)，對酒的感官品質(zhì)有積極貢獻(xiàn)，為酒帶來新鮮感并平衡果香[27]；大于閾值時(shí)，則會給香氣帶來負(fù)面影響[28].本試驗(yàn)酒樣中共檢測出14種脂肪酸類物質(zhì)，由表2可知，100 MPa處理后脂肪酸的含量與對照組相比變化不大，200 MPa下脂肪酸總含量較低，其中P200-1處理的酒中脂肪酸含量最低，且和其他組存在顯著性差異.辛酸含量最高，其次為乙酸、正癸酸、己酸等，這幾種酸的含量隨著壓強(qiáng)的增大而降低，這說明新鮮干紅葡萄酒經(jīng)瞬時(shí)超高壓處理后，分子間發(fā)生了劇烈碰撞，酯化反應(yīng)加快，消耗了脂肪酸[26].脂肪酸與醇類物質(zhì)含量的降低均是由于酒體本身受到強(qiáng)烈撞擊而相互碰撞、摩擦剪切，使得分子間的氫鍵、離子鍵、疏水鍵發(fā)生變化，等到泄壓后恢復(fù)不了原來空間結(jié)構(gòu)而造成的.

2.2.4 萜烯類化合物 萜烯類化合物為葡萄的次級代謝產(chǎn)物，一般作為葡萄酒特征品種香，存在形式主要為鍵合態(tài)，在釀造過程中由于糖苷酶酶解為揮發(fā)性的游離態(tài)香氣化合物[29].試驗(yàn)酒樣中共檢出6種萜烯，對照組與處理組共有的為5種，其中香茅醇含量和大馬士酮的含量較高.但我們發(fā)現(xiàn)超高壓均質(zhì)處理對萜烯類物質(zhì)的影響并沒有呈現(xiàn)一定的規(guī)律.

2.3 超高壓均質(zhì)處理對‘赤霞珠’葡萄酒香氣感官表現(xiàn)影響

我們根據(jù)香氣的感官特征并參照葡萄酒香氣輪盤進(jìn)行劃分[30]，將‘赤霞珠’葡萄酒香氣成分劃分為9個(gè)系列，1為土壤味，2為堅(jiān)果味，3為花香味，4為果香味，5為焦糖味，6為植物味，7為脂肪味，8為微生物，9為刺鼻味.根據(jù)各香氣化合物閾值與濃度計(jì)算各系列香氣成分活性值(OAV)并計(jì)算香氣強(qiáng)度值[15,29,31-34]，如表2所示.一般認(rèn)為，OAV>1表示該物質(zhì)對葡萄酒的香氣貢獻(xiàn)率較大，為樣品的主體呈香物質(zhì)[16].本試驗(yàn)中OAV>1的物質(zhì)有15種.其中辛酸乙酯的OAV值最高.

表3 不同處理‘赤霞珠’干紅葡萄酒香氣成分活性值(OVA)及特征描述

“-”表示未檢測到香氣成分；“”表示OAV<0.01；

“-” indicates that the aroma component is not detected in the wine sample；“”indicates OAV<0.01.

圖1 對照與處理酒樣在超高壓前與超高壓后香氣輪廓的差異香氣強(qiáng)度對比Figure 1 Total OAV differents of wine aroma series between two stsges (before and after UHPH)

為了明確高壓對新鮮‘赤霞珠’干紅葡萄酒香氣輪廓的影響，我們對超高壓處理后與處理前的酒樣香氣輪廓各組的OAV相減作圖.由圖1可知，葡萄酒中香氣貢獻(xiàn)較大的是果香味、花香味、脂肪味、植物味.超高壓處理后葡萄酒中的花香、果香、焦糖香及脂肪味都不同程度的升高，其中果香改變最大，泥土味、植物味以及刺鼻味明顯降低，這說明瞬間動(dòng)態(tài)高壓處理后酒中的香氣成分與含量發(fā)生明顯的改變，對葡萄酒的香氣品質(zhì)有極大的促進(jìn)作用.葡萄酒中的花果香主要來自于酯類與萜烯類化合物，由表2可知，對酯類中OAV貢獻(xiàn)較大的香氣物質(zhì)為辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙酯，萜烯中主要為大馬士酮.除P100-1外，P100-2、P100-3、P200-1、P200-2、P200-3組果香都高于對照，而且隨著壓強(qiáng)及循環(huán)次數(shù)的增加不斷升高，OAV分別高于對照1.5%、10.9%、18.8%、27.0%、34.3%.對于花香，P100-1、P100-2組低于對照，P100-3以及P200-1，P200-2，P200-3花香均高于對照，分別高于對照6.4%、4.2%、16.9%、26.0%.脂肪味主要來自于脂肪酸和個(gè)別酯類，本試驗(yàn)處理組中只有P100-1、P100-2組低于對照，其他組則相反，其中P200-1與P200-2條件下對酒中脂肪味貢獻(xiàn)較大.酒中的具有植物味香氣的物質(zhì)主要為C6化合物，本試驗(yàn)酒樣中發(fā)現(xiàn)對OAV貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)為正己醇、3-己烯-1-醇.在超高壓處理下，這幾種物質(zhì)含量均降低，很大程度上降低了酒中生青植物味.泥土味和刺鼻味為酒中一些不良的香氣，本試驗(yàn)中主要貢獻(xiàn)物質(zhì)為1-辛烯-3-醇、1-戊醇.同樣經(jīng)過不同的壓力與循環(huán)次數(shù)處理后降低了這兩種物質(zhì)的含量，從而減少了酒中的泥土味與刺鼻味.

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究動(dòng)態(tài)超高壓均質(zhì)技術(shù)對‘赤霞珠’干紅葡萄酒風(fēng)味的影響，并得出了一定的結(jié)論，其中色度和總花色苷含量逐漸增加，醇與脂肪酸的含量降低，酯類化合物含量上升，香氣構(gòu)成中花香、果香、焦糖香、脂肪味等香氣都有所提高，不良的風(fēng)味有所降低，如：泥土味與植物味；試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)壓強(qiáng)對風(fēng)味影響較大，其中200 MPa下效果較好，但與循環(huán)次數(shù)不成正比.

后期待解決問題：超高壓均質(zhì)的壓力最高可達(dá)400 MPa，但國內(nèi)儀器較難實(shí)現(xiàn)，如條件容許，可探索更高壓強(qiáng)對葡萄酒香氣的影響.