張健，董星晨，張鶴，鄧德雷，羅超越，張春紅，邱慧珍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

地處甘肅省中部的定西市是我國重要的馬鈴薯種薯和商品薯生產(chǎn)及淀粉加工基地[1]，有“中國馬鈴薯之鄉(xiāng)”之稱[2]，是甘肅省最大的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已成為帶動農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展，促進農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的戰(zhàn)略性主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)[3].然而農(nóng)民為追求高產(chǎn)和高收益，在馬鈴薯種植過程中肥料投入、尤其是氮肥的投入量持續(xù)增加，盲目施肥現(xiàn)象十分嚴(yán)重[4].氮肥的過量投入，不僅沒有達到預(yù)期的產(chǎn)量，反而降低了馬鈴薯塊莖的品質(zhì)、尤其是窖藏品質(zhì)[1，3-4]，更為重要的是，長期大量施氮在降低氮肥利用率的同時，導(dǎo)致土壤剖面中硝酸鹽富集，造成嚴(yán)重的資源浪費以及環(huán)境污染[5-6]，并且顯著影響了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性[7-10].土壤細(xì)菌作為主導(dǎo)農(nóng)田土壤微生物的主要類群，可以敏感響應(yīng)土壤養(yǎng)分含量及土壤肥力的變化.本研究設(shè)置長期定位試驗研究，運用傳統(tǒng)的土壤農(nóng)化分析方法結(jié)合克隆測序以及實時熒光定量PCR等分子生態(tài)學(xué)研究手段，探討連續(xù)4 a施氮對旱地馬鈴薯田土壤剖面中硝態(tài)氮的積累以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在探明長期連續(xù)施氮對土壤剖面硝態(tài)氮含量的影響以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性對不同施氮量的響應(yīng)機制.

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

田間定位試驗始于2013年4月，試驗地位于甘肅省定西市安定區(qū)香泉鎮(zhèn)(N 35°27′7″，E 104°30′34″)，海拔2 053～2 556 m，年均溫度6.9 ℃，年降水量400 mm左右，多集中在7～9月.無霜期140 d，80%保證率≥10 ℃的積溫為2 075.1 ℃，蒸發(fā)量1 400 mm以上,屬中溫帶半干旱氣候.

1.2 試驗設(shè)計

田間試驗設(shè)置6個不同施氮處理：N0對照；N75(施氮量75 kg/hm2)；N150(施氮量150 kg/hm2)；N225(施氮量225 kg/hm2)；N300(施氮量300 kg/hm2)；N375(施氮量375 kg/hm2).每個處理4次重復(fù)，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積7.2×9=64.8 m2,采用寬壟雙行覆膜種植模式，壟寬1.2 m，壟間距0.4 m，行距0.6 m，株距0.2 m,種植密度為8.34×104株/hm2.

每個處理肥底一致，施磷量：P2O5225 kg/hm2，施鉀量：K2O 292.5 kg/hm2.N肥為尿素(N,46%)，P肥為過磷酸鈣(P2O5,16%),鉀肥為硫酸鉀鎂(K2O,24%).

供試品種為馬鈴薯‘青薯九號’.田間試驗于2016年5月1日播種，10月9日收獲.按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方法進行田間管理.

1.3 土壤樣品采集

在馬鈴薯收獲期采集0～20、20～40、40～60、60～80、80～100 cm土壤樣品，測定不同土層土壤硝態(tài)氮含量.同時，對0～20 cm表層土壤采用克隆測序以及實時定量PCR方法測定細(xì)菌的群落組成和結(jié)構(gòu).

1.4 測定指標(biāo)及方法

土壤NO3--N和NH4+-N含量的測定：0.01 mol/L CaCl2溶液浸提，震蕩1h,用流動分析儀測定.

土壤pH測定：水土比為5∶1，用pH計測定.

土壤有機質(zhì)的測定：重鉻酸鉀外加熱法.

DNA提?。豪肍ast DNA Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)，按照其說明書中的步驟提取土壤總DNA.DNA提取后，分別采用微量紫外分光光度計(Nanodrop ND-1000 UV-Vis)測定土壤DNA的濃度和純度(D260/D280和D260/D230).之后將其稀釋10倍用于PCR模板.

實時熒光定量PCR：采用Bio-Rad CFX96 Optical Real-Time PCR System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)擴增儀進行實時熒光定量PCR分析.標(biāo)線取自基因代表性克隆重組質(zhì)粒的10倍稀釋樣，稀釋梯度6到8個，空白樣品的模板為水.然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度計算出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以每克干土中的基因拷貝數(shù)為單位進行分析，每個樣品3次重復(fù).

定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL DNA模板、10 μL SYBRPremixExTaq(TaKaRa,Dalian,China)，正向和反向引物分別為0.25 μL(10 μmol/L)和8.5 μL的滅菌雙蒸水.優(yōu)化后的PCR程序如表1.

表1 本研究所用的引物和條件

2 結(jié)果與分析

2.1 長期施氮對土壤剖面中硝態(tài)氮NO3--N含量的影響

馬鈴薯收獲期土壤剖面各土層中NO3--N含量的測定結(jié)果如表2所示：連續(xù)4 a施氮，導(dǎo)致0～100 cm內(nèi)土壤剖面中NO3--N含量隨著施氮量增加顯著增加(P<0.05)，尤其在0～20 cm土壤樣品中，各處理土壤NO3--N含量分別為4.3、6.7、9.2、11.3、20.0、46.8 mg/kg，各施氮處理的NO3--N含量分別比對照N0增加了55.8%、113.9%、162.8%、365.1%和988.4%.；在各土壤剖面內(nèi)NO3--N含量也不相同，隨著土壤剖面深度增加，其

含量逐漸降低.

2.2 長期施氮對表層土壤理化性質(zhì)的影響

連續(xù)5 a不同施氮量，隨著施氮量增加，土壤pH表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，在N75處理中達到最大值為8.36，在N375處理達到最低8.02，與N0相比降低了0.26，說明長期過量施氮會造成土壤pH降低.NH4+-N的含量并未隨著施氮量增加而出現(xiàn)有規(guī)律的變化.通過對土壤OM含量的測定結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，各處理土壤OM含量均未達到統(tǒng)計學(xué)差異水平，但是N150處理的土壤OM含量為18.15 g/kg,明顯要高于其他處理.因此，在合理的施氮范圍內(nèi)，長期施氮可以增加土壤OM的含量.

表2 不同施氮量土壤NO3--N含量

表3 不同施氮處理的部分表層土壤理化性質(zhì)

2.3 長期施氮對細(xì)菌Alpha多樣性的影響

根據(jù)高通量測序結(jié)果，表3中列出了各處理土壤樣品中在相似性0.97條件下得到的Alpha多樣性指數(shù)，其中OTU和Chao1指數(shù)是表征群落豐富度的指數(shù)，OTU越高，代表物種種類越多，Chao1值越大，物種豐度越高；Shannon和simpson指數(shù)是表征微生物多樣性指數(shù)，shanon指數(shù)越大，物種多樣性越高，simpson指數(shù)越大，物種多樣性越低.隨著施氮量增加，各處理僅在N375處理土壤樣品中，shannon指數(shù)顯著低于其他施氮處理，而simpson指數(shù)顯著高于其他處理，雖然各處理OTU與Chao1指數(shù)雖沒有顯著性差異，但相比其他處理，N375處理的土壤樣品OTU與Chao1值最低，這說明過量施氮可以降低細(xì)菌的多樣性.

表4 不同施氮量處理的土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

2.4 長期施氮對細(xì)菌群落組成的影響

2.4.1 長期施氮對土壤門水平細(xì)菌優(yōu)勢類群的影響 為分析長期連續(xù)施氮對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，利用meseq高通量測序及實時熒光定量PCR等微生物學(xué)研究方法對0～20 cm表層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進行分析.結(jié)果如圖1所示，在門水平上不同施氮處理土壤中排名前9的細(xì)菌優(yōu)勢類群中，Proteobacteria(變形菌門)，Acidobacteria(酸桿菌門)，Actinobacteria(放線菌門)有絕對的優(yōu)勢，在各處理中占60%左右.隨著施氮量的增加各處理的門的絕對量發(fā)生了變化，在0～20 cm土樣內(nèi)Actinobacteria(放線菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)的豐度顯著提高，(Acidobacteria)酸桿菌門的豐度顯著降低，相比于N0處理，各處理中Actinobacteria細(xì)菌數(shù)量增加6.1%～17.4%.Bacteroidetes中細(xì)菌數(shù)量增加了16.4%～46.8%.Acidobacteria中細(xì)菌數(shù)量減少7.8%～26.4%.

圖1 不同施氮量處理土壤細(xì)菌優(yōu)勢門水平的分布特征Figure 1 Distribution characteristics of soil microorganisms at gate level under different nitrogen treatments

2.4.2 長期施氮對土壤優(yōu)勢綱細(xì)菌類群的影響 為了進一步分析長期施氮對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對不同處理在綱水平上優(yōu)勢細(xì)菌類群進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖2所示，在綱水平上不同施氮處理土壤中前12個優(yōu)勢菌群中，放線菌門中的Actinobacter，酸桿菌門中的AcidobacterGp6以及變形菌綱中的Betaproteobacteria(β-變形菌綱)、Gammaproteobacteria(α-變形菌綱)和Alphaproteobacteria(α-變形菌綱)占絕對優(yōu)勢，在各處理中占總優(yōu)勢菌綱的40%左右.隨著施氮量增加，擬桿菌門中的Bacteroidetesinceratesedis(擬桿菌綱)和Actinobacter(放線菌綱)細(xì)菌的豐度顯著增加(P<0.05)，與對照N0相比，隨著施氮量增加，各處理擬桿菌綱細(xì)菌的豐度分別增加了33.8%、44.8%、83.3%、109.2%、173.3%.而AcidobacterGp4和Anaerolineae隨著施氮量增加顯著降低(P<0.05)，較N0相比，隨著施氮量增加，各處理AcidobacterGp4和Anaerolineae相對豐度分別降低16.3%～33.8%、8.1%～22.7%；Gemmatimonadetes(芽單胞菌綱)、AcidobacterGp6隨著施氮量增加均呈現(xiàn)出先增加后將低的趨勢，在各處理中的相對豐度分別為N0(1.48%，11.92%)、N75(1.80%，14.36%)、N150(1.43%，9.64%)、N225(1.45%，11.34%)、N300(1.50%，8.92%)、N375(1.19%，8.99%)；AcidobacterGp6的豐度隨著施氮量增加而逐漸降低，但各處理之間差異并不顯著.

圖2 不同施氮量處理優(yōu)勢綱水平的分布Figure 2 Distribution of dominant class levels under different nitrogen application rates

2.4.3 長期施氮對土壤細(xì)菌優(yōu)勢屬類群的影響 對各處理中細(xì)菌的優(yōu)勢門和優(yōu)勢綱類群的群落組成分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)四年施氮顯著影響了表層土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，因此，對其進行深入研究發(fā)現(xiàn)，排名前12的優(yōu)勢屬中，有6個優(yōu)勢屬分別是Nocardioides(類諾卡氏菌屬)、Gaiella、Arthrobacter(節(jié)桿菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)、Solirubrobacter(土壤紅桿菌屬)、Blastococcus等屬于放線菌綱，2個優(yōu)勢屬屬Lysobacter(溶桿菌屬)、Steroidobacter(甾桿菌屬)屬于變形菌門，Ohtaekwangia屬于擬桿菌門，其中，大多數(shù)與硝化作用有關(guān)的微生物隸屬于變形菌門[11]，Nocardioides、Arthrobacter、Gemmatimonas中的大多數(shù)細(xì)菌已經(jīng)被證實可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[12].而Ohtaekwangia是新發(fā)現(xiàn)的屬屬于擬桿菌門[13]，而擬桿菌門中的細(xì)菌被證實與土壤反硝化作用有關(guān)[14].Gemmatimonas具有脫氮的功能[15].與N0處理相比，各施氮處理土壤中隨著施氮量增加Ohtaekwangia、Streptomyces和Lysobacter的豐度顯著增加，各處理中相對豐度為N0(1.19%，1.15%，0.93%)、N75(1.59%,1.01%，0.95%)、N150(1.72%,2.76%，1.26%)、N225(2.18%,1.23%，1.27%)、N300(2.49%，1.60%，1.63%)、N375(3.25%，1.98%，1.89%)；各施氮處理的Ohtaekwangia和Streptomyces細(xì)菌的豐度分別比對照增加了33.6%～173.1%和3.4%～66.4%，而Gaiella和Solirubrobacter細(xì)菌的豐度分別比對照N0降低了6.9%～30.8%和4.5%～27.6%.Arthrobacter、Nocardioides的豐度隨施氮量增加明顯呈上升趨勢，但各處理之間并沒有明顯差異，因此，可以確定連續(xù)施氮有選擇性的改變了土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu).

圖3 不同施氮處理土壤優(yōu)勢屬的分布Figure 3 Distribution of dominant genera in different nitrogen treatments

2.5 長期施氮對細(xì)菌群落結(jié)果和多樣性對不同施氮量的響應(yīng)機制

為進一步揭示影響土壤細(xì)菌優(yōu)勢群落組成對不同施氮量的響應(yīng)機制，對不同施氮量處理土壤優(yōu)勢細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和部分土壤理化性質(zhì)做冗余分析(RDA)，可以明確得出長期不同施氮量引起的土壤環(huán)境因子的變化與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，結(jié)果如圖4所示，土壤pH(P=0.008)和土壤NO3--N濃度(P=0.041)對微生物群落影響最為顯著，2個序列軸分別解釋了17.42%、5.15%的群落變化，因此，初步確定土壤pH和土壤NO3--N濃度的改變是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要土壤環(huán)境因子.

2.6 優(yōu)勢細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

為進一步確定影響細(xì)菌的優(yōu)勢菌群的環(huán)境因子，將土壤部分理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分布做相關(guān)性分析，結(jié)果表明，除了在門水平、綱水平以及屬水平的相對豐度的變化與pH和NO3--N含量具有明顯的相關(guān)性，其中與pH呈顯著正相關(guān)但與NO3--N含量顯著負(fù)相關(guān)的菌群有Acidobacte-ria、Gemmatimonadetes，AcidobacteriaGP6、AcidobacteriaGP4，Gemmatimonas、Solirubrobacter；與pH呈顯著負(fù)相關(guān)同時與NO3--N含量呈顯著正相關(guān)的細(xì)菌優(yōu)勢菌群有Bacteroidetes、Bacteroidetesincertaesedis、Ohtaekwangia、Streptomyces.盡管從RDA分析還是相關(guān)性分析結(jié)果來看，pH都是顯著影響細(xì)菌優(yōu)勢菌群變化的因子，但是隨著施氮量升高，土壤pH相比于其他處理僅在最高施氮量處理條件下降低了0.3個單位，然而，大多數(shù)細(xì)菌都生活在pH為4～9的環(huán)境中[11]，且大多都能承受pH在0～1個單位之間的變化量，因此引起土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的最主要的環(huán)境因子是NO3--N含量，而并非土壤pH值.

圖4 不同施氮量處理土壤優(yōu)勢細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤部分理化性質(zhì)RDA分析Figure 4 RDA analysis of soil dominant bacteria community structure and soil physicochemical properties under different nitrogen application rates

表5 細(xì)菌優(yōu)勢門與土壤部分理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

*表示P<0.05,**表示P<0.01.* meansP<0.05,** meansP<0.01.

表6 細(xì)菌優(yōu)勢綱與部分土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

*表示P<0.05,**表示P<0.01.* meansP<0.05,** meansP<0.01.

*表示P<0.05,**表示P<0.01.* meansP<0.05,** meansP<0.01.

3 討論

3.1 長期施氮對土壤剖面NO3--N含量和土壤pH的影響

氮素是作物生長發(fā)育過程中的必需大量元素之一，在作物生命活動和產(chǎn)量形成中有著不可替代的作用[16]，氮肥的施用量不足，造成作物產(chǎn)量較低且土壤氮肥肥力大量耗竭，而施氮量過高，不僅造成資源的浪費，同時因過量施氮而引起土壤硝酸鹽富集，造成水體和大氣環(huán)境的污染[5].土壤NO3--N是作物吸收氮素的主要形態(tài)之一，其豐缺程度能有效表征土壤供氮狀況[17].尿素在施入土壤后，會先經(jīng)過脲酶水解，產(chǎn)生氨，NH4+進一步硝化生成NO3--N，使得大量NO3--N在土壤中累積，同時在硝化過程中產(chǎn)生大量H+,使土壤pH下降[18].本研究結(jié)果表明，連續(xù)4 a施用尿素，導(dǎo)致土壤pH降低，尤其是高施氮肥處理N375，土壤pH值下降了0.3個單位，且隨著施氮量增加，土壤剖面中NO3--N含量顯著增加，造成土壤NO3--N大量累積，土壤硝酸鹽富集，對地下水以及大氣環(huán)境帶來潛在風(fēng)險.

3.2 長期施氮對細(xì)菌AlpHa多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，

大量研究表明，過量使用氮肥會導(dǎo)致土壤細(xì)菌多樣性降低[8，19]，使得土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在本研究中，連續(xù)4 a施氮，相比于其他處理，僅N375處理shannon指數(shù)顯著低于其他施氮處理，而simpson指數(shù)顯著高于其他處理，同時最高施氮量處理N375的土壤樣品OTU與Chao1值最低，說明長期過量施氮可以降低土壤細(xì)菌多樣性，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致.有研究表明在美國的長期N投入試驗中觀察到，高N施入增加了豐富類群(變形菌門和擬桿菌門)的相對豐度，降低了貧瘠類群(酸桿菌門)的相對豐度[19].在土壤營養(yǎng)物質(zhì)增加時，豐富類群能利用有效碳源快速生長，因此可以在較高氮含量的環(huán)境下較好的生長繁殖，而貧瘠類群在環(huán)境中生長速度較低，吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力較弱，因此在營養(yǎng)物質(zhì)較高時，這些貧瘠類群與豐富類群相比競爭力較弱，不能良好的生長繁殖[20]，導(dǎo)致其數(shù)量下降.本研究結(jié)果表明，連續(xù)4 a施氮，各處理優(yōu)勢菌門的絕對量發(fā)生了變化，與N0相比，在0～20 cm土層內(nèi).土壤放線菌門和擬桿菌門的豐度隨著施氮量增加顯著提高，酸桿菌門的豐度顯著降低，土壤變形菌門豐度隨著施氮量增加雖整體呈上升趨勢，但各處理之間并沒有顯著性差異.這與前人研究結(jié)果一致，由于長期施氮導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮含量顯著增加，土壤營養(yǎng)物質(zhì)增加，從而促進了豐富類群的生長，抑制了貧瘠類群的生長.

有研究報道[21-22]變形菌門中許多細(xì)菌類群參與了土壤氮素循環(huán)，與硝化作用有關(guān)的細(xì)菌大多數(shù)屬于變形菌門中的β-變形菌綱和r-變形菌綱，而許多不同種類的細(xì)菌都具有反硝化功能，如放線菌門，厚壁菌門，擬桿菌屬以及變形菌門中的一些細(xì)菌[23]，在本研究中，施氮明顯促進了r-變形菌綱細(xì)菌類群的生長，且檢測出來的兩種優(yōu)勢屬水平的菌群Lysobacter(溶桿菌屬)、Steroidobacter(甾桿菌屬)、均屬于r-變形菌綱，Nitrospira(硝化螺菌屬)的豐度隨著施氮量增加而升高，值得注意的是，檢測出來的Azotobacter(固氮菌屬)雖說豐度較低，但是相比施氮處理，不施氮處理中Azotobacter的豐度是施氮處理的1.25～2.15倍.說明不施氮處理顯著刺激了土壤Azotobacter的生長.氮素的添加能夠促進土壤放線菌門細(xì)菌的生長[24]，本研究發(fā)現(xiàn)排名前12的優(yōu)勢屬中，有6個優(yōu)勢屬分別是Nocardioides(類諾卡氏菌屬)、Gaiella、Arthrobacter(節(jié)桿菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)、Solirubrobacter(土壤紅桿菌屬)、Blastococcus等屬于放線菌綱，其豐度占整個優(yōu)勢屬豐度的41.88%，其中Nocardioides，Arthrobacter都能將土壤中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[12]，且隨著施氮量增加，其豐度顯著升高.而擬桿菌門的豐度整體來說是隨著施氮量下降的，但檢測出來的優(yōu)勢綱Bacteroidetesincrete(擬桿菌綱)以及Ohtaekwangia的豐度均隨著施氮量升高顯著升高，Ohtaekwangia是新發(fā)現(xiàn)的屬于擬桿菌門噬纖維菌科中的新屬[13]，其具體的生活習(xí)性鮮見報道，因此，推測擬桿菌門中的Bacteroidetesincrete以及Ohtaekwangia的細(xì)菌與反硝化作用密切相關(guān).Gemmatimonadates(芽孢單菌門)中細(xì)菌類群具有很強的反硝化功能,Gemmatimonadates(芽單胞菌屬)具有脫氮的功能[24].但本研究結(jié)果中與前人研究結(jié)果相悖[24-25]的是隨著施氮量增加，Gemmatimonadates的豐度顯著降低，前人研究結(jié)果表明，水氮一體的環(huán)境條件下Gemmatimonadates的豐度隨著施氮量增加而顯著增加，因此推測，Gemmatimonadates對土壤水分的敏感程度較高，而在旱地土壤中，由于水分不足導(dǎo)致Gemmatimonadates隨著施氮量升高反而呈降低趨勢.

值得注意的是，隨著施氮量增加而增加的細(xì)菌優(yōu)勢屬還有Lysobacter(溶桿菌屬)和(Streptomyces)鏈霉菌屬，而溶桿菌屬細(xì)菌可以抑制一些土傳真菌病害，如水稻白葉枯病、辣椒疫病，對立枯絲核菌具有明顯的抑制作用[26]；而鏈霉菌屬細(xì)菌可以產(chǎn)生抗真菌活性，抗細(xì)菌活性以及抗病毒的毒素[12]，在本研究中，可能是由于連作和長期施氮，導(dǎo)致一些對馬鈴薯生長有害的細(xì)菌或真菌大量繁殖，刺激了溶桿菌屬和鏈霉菌屬的生長.

3.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與部分土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

長期施氮顯著影響了土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)，RDA分析表明，長期施氮引起的土壤硝態(tài)氮含量和土壤pH變化是影響土壤細(xì)菌群結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子，這與相關(guān)性分析結(jié)果一致，然而，大多數(shù)細(xì)菌都生活在pH為4～9的環(huán)境中，且大多都能承受pH在0～1個單位之間的變化量[11]，而本研究發(fā)現(xiàn)隨著施氮量升高，土壤pH相比于其他處理僅在最高施氮量處理條件下降低了0.3個單位，因此確定了引起土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的最主效土壤環(huán)境因子是NO3--N含量，而并非土壤pH值.

隨著施氮量升高，土壤NO3--N含量顯著升高，與NO3--N含量顯著負(fù)相關(guān)的菌群有Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)，AcidobacteriaGP6、AcidobacteriaGP4，Gemmatimonas(芽單胞菌屬)、Solirubrobacter(土壤紅桿菌屬)；這是由于酸桿菌門屬于貧瘠類群[20]，在較高的營養(yǎng)環(huán)境中生存競爭力不如像放線菌門，擬桿菌門這種富營養(yǎng)類群，所以在較高營養(yǎng)環(huán)境下反而不利于其生長繁殖.但是與前人研究結(jié)果不一致[24.25]的是Gemmatimonadetes及Gemmatimonas的豐度與土壤硝態(tài)氮含量顯著負(fù)相關(guān).與硝態(tài)氮含量顯著正相關(guān)的細(xì)菌類群有Bacteroidetes(擬桿菌門)、Bacteroidetesincertaesedis(擬桿菌綱)、Arthobacter(節(jié)桿菌屬)、Nocardioides(類諾卡氏屬)、Ohtaekwangia、Streptomyces(鏈霉菌屬)，Lysobacter(溶桿菌屬),其中Bacteroidetes、Bacteroidetesincertaesedis、Arthobacter、Nocardioides被證實均與反硝化作用有關(guān)，可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，因此長期施氮導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮含量升高，進而影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，而Streptomyces，Lysobacter也隨著施氮量的升高而升高，可能是因為長期施氮和連作引起的.

4 結(jié)論

連續(xù)4 a施氮顯著提高了土壤剖面中硝態(tài)氮的含量，隨著施氮量升高，土壤剖面中硝態(tài)氮含量顯著增加，尤其在0～20 cm土壤中各施氮處理各處理土壤NO3--N含量分別為4.3，6.7，9.2，11.3，20.0，46.8 mg/kg，分別比對照增加了55.8%,113.9%,162.8%,365.1%和988.4%

連續(xù)施氮顯著改變了表層土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，降低了土壤細(xì)菌的群落多樣性.連續(xù)四年施氮，隨著施氮量的增加各處理的門的絕對量發(fā)生了變化，隨著施氮量增加，各施氮處理土壤放線菌門和擬桿菌門的細(xì)菌的豐度分別比對照N0處理增加了6.1%～17.4%和16.4%～46.8%，酸桿菌門的豐度比對照降低了7.8%～26.4%.在綱水平上的土壤優(yōu)勢細(xì)菌類群中，與對照N0相比，隨著施氮量增加，各處理擬桿菌綱細(xì)菌的豐度分別增加了33.8%、44.8%、83.3%、109.2%、173.3%.而AcidobacterGp4和Anaerolineae隨著施氮量增加顯著降低(P<0.05)，較N0相比，隨著施氮量增加，各處理AcidobacterGp4和Anaerolineae相對豐度分別降低16.3%～33.8%、8.1%～22.7%；在屬水平上的土壤優(yōu)勢細(xì)菌類群中，各施氮處理的Ohtaekwangia和Streptomyces細(xì)菌的豐度分別比對照增加了33.6%～173.1%和3.4%～66.4%，而Gaiella和Solirubrobacter細(xì)菌的豐度分別比對照N0降低了6.9%～30.8%和4.5%～27.6%.連續(xù)過量施氮也顯著降低了土壤細(xì)菌的群落多樣性.RDA及相關(guān)性分析表明土壤硝態(tài)氮含量的變化是導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要土壤環(huán)境因子.