魏譚軍， 梁 源， 王 毅?， 王 張， 肖 成， 胡鳳嬌， 周殿儒， 孫位軍

（1.達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川達(dá)州 635000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 611137）

乳腺增生是育齡婦女最常見(jiàn)的乳房疾病，其發(fā)病率居乳腺疾病首位，近年來(lái)明顯升高，多發(fā)于30～50歲婦女，癌變危險(xiǎn)為健康婦女的1.4～1.5倍，癌變率為10%左右[1］。多發(fā)乳腺增生病可由不良刺激等因素導(dǎo)致女性內(nèi)分泌功能紊亂，雌激素、孕激素比例失衡，刺激乳腺組織過(guò)度增生引起[2］。目前西醫(yī)大多采用激素治療[3］，中醫(yī)認(rèn)為，乳腺增生與肝腎沖任等脈有密切聯(lián)系，而且中藥在調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌治療乳腺增生療效顯著，已廣泛應(yīng)用[4-5］。

理氣散結(jié)顆粒由柴胡、香附、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎、當(dāng)歸、白芍組成，具有理氣調(diào)血、散結(jié)止痛的功效，主治肝郁血瘀、乳腺增生、乳癖結(jié)塊、乳癰初起、乳房脹痛。本實(shí)驗(yàn)采用苯甲酸雌二醇和黃體酮誘導(dǎo)大鼠乳腺增生模型，探討理氣散結(jié)顆粒對(duì)該模型的影響。

1 材料

1.1 試藥 理氣散結(jié)顆粒 （批號(hào)151125）、理氣散結(jié)丸 （批號(hào)160812） （達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）；他莫昔芬 （上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號(hào)160503）；小金丸 （九寨溝天然藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，批號(hào)160114）；氯化鈉注射液 （四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)B16040811）；苯甲酸雌二醇注射液[6-10］（寧波第二激素廠，批號(hào)160623）；黃體酮注射液 （浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)151216）；水合氯醛 （成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100614）；多聚甲醛 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20161212、20160512）。大鼠E2ELISA試劑盒 （批號(hào) XL-Er0478）、孕酮ELISA試劑盒 （批號(hào) XL-Er0477）、雌激素受體（ER） （批號(hào)ab75635）、孕激素受體 （PR） （批號(hào)ab2765） （英國(guó)Abcam公司）。

1.2 儀器 電子天平 [賽多利斯科學(xué)儀器 （北京）有限公司］；低速離心機(jī) （湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電子恒溫水浴鍋 （北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀 （上海特康科技有限公司）；酶標(biāo)儀 [賽默飛世爾科技 （中國(guó)）有限公司］；全玻璃注射器 （國(guó)營(yíng)上海醫(yī)用激光儀器廠）；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī) （常州市中威電子儀器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀 （常州市中威電子儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性大鼠96只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)51203500001212，許可證號(hào)SCXK （川）2015-030。

2 方法

2.1 分組 大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、他莫昔芬組 （0.003 3 g／kg）、小金丸組（0.200 0 g／kg）、 理氣散結(jié)丸組 （1.957 0 g／kg）及理氣散結(jié)顆粒低、中、高劑量組 （0.978 5、1.957 0、 3.914 0 g／kg）， 每組 12 只。

2.2 造模及給藥 空白對(duì)照組大鼠于后肢左右交替肌肉注射生理鹽水 （0.1 mL／只）；其余各組大鼠每天肌肉注射苯甲酸雌二醇0.000 5 g／kg，共25 d，再每天肌肉注射黃體酮 0.004 0 g／kg，共5 d[11］。理氣散結(jié)顆粒、他莫昔芬、小金丸臨用前用生理鹽水配成混懸液，于造模當(dāng)天[11］灌胃給藥，每天1次，連續(xù)30 d；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠灌胃生理鹽水，給藥量均為20 mL／kg。

2.3 血清E2、P水平測(cè)定 末次給藥后禁食不禁水24 h，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血5 mL，3 000 r／min離心10 min分離血清，取上清液，ELISA試劑盒按酶聯(lián)免疫吸附法，測(cè)定血清E2、P水平。

2.4 乳腺組織病理變化觀察 取各組大鼠第2對(duì)右側(cè)乳頭及其下乳房組織[12］，4%多聚甲醛溶液固定，全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，部分進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察乳腺組織增生程度，對(duì)乳腺小葉、腺泡等計(jì)數(shù)，描述小葉導(dǎo)管和腺泡的分泌、上皮增生脫落情況及腺泡結(jié)締組織，并按表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行乳腺增生評(píng)級(jí)。

2.5 ER、PR蛋白表達(dá)檢測(cè) 應(yīng)用免疫組化法對(duì)大鼠乳腺組織中ER、PR蛋白進(jìn)行陽(yáng)性表達(dá)分析，在圖像分析系統(tǒng)中測(cè)定兩者光密度和面積。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以s）表示，采用方差分析；等級(jí)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 乳腺組織病理變化 圖1、表2顯示，模型對(duì)照組大鼠乳腺組織中乳腺小葉和腺泡數(shù)量明顯增加，腺上皮細(xì)胞排列雖較正常，但有空泡變性（10／12）、 增生 （6／12）、 脫落 （2／12）、 壞死（2／12）表現(xiàn)，部分間質(zhì)因纖維組織增生而增寬，腺泡大小不等，管腔壁變??；與模型對(duì)照組比較，理氣散結(jié)顆粒低劑量組乳腺組織增生明顯改善（P＜0.05），具體表現(xiàn)為3／10的乳腺組織無(wú)增生，乳腺小葉和腺泡數(shù)量減少，腺上皮細(xì)胞空泡變性、增生、脫落變化減少，無(wú)壞死。

表1 大鼠乳腺增生評(píng)級(jí)Tab.1 Rating of rat mammary gland hyperplasia

圖1 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)變化 （HE，×400）Fig.1 Pathomorphological changes of rat mammary gland tissue in various groups（HE， ×400）

表2 各組大鼠乳腺組織病理切片等級(jí)Tab.2 Pathological section grades of rat mammary gland tissue in various groups

3.2 理氣散結(jié)顆粒對(duì)E2、P水平的影響 表3顯示，與模型對(duì)照組比較，理氣散結(jié)高劑量組大鼠E2水平顯著增加 （P＜0.05）；各劑量組P水平均無(wú)顯著變化 （P＞0.05），但中、高劑量組降低作用顯著強(qiáng)于理氣散結(jié)丸組 （P＜0.05）。

3.3 理氣散結(jié)顆粒對(duì)ER、PR蛋白表達(dá)的影響圖2～3、表4顯示，與模型對(duì)照組比較，理氣散結(jié)顆粒中、高劑量組ER蛋白表達(dá)顯著降低 （P＜0.05），同時(shí)高劑量組 PR蛋白表達(dá)也顯著降低（P＜0.01）。

表3 理氣散結(jié)顆粒對(duì)E2、P水平的影響 （Tab.3 Effects of Liqi Sanjie Granules on E2and P levels

表3 理氣散結(jié)顆粒對(duì)E2、P水平的影響 （Tab.3 Effects of Liqi Sanjie Granules on E2and P levels

注：與模型對(duì)照組比較，?P＜0.05；與理氣散結(jié)丸組比較，#P＜0.05

空白對(duì)照組 — 10 124.92±18.92 5.07±1.00模型對(duì)照組 — 12 113.26±22.00 4.18±0.87他莫昔芬組 0.003 3 9 142.17±30.19? 4.67±0.63小金丸組 0.200 0 11 132.23±15.35? 4.69±0.65理氣散結(jié)丸組 1.957 0 10 127.58±27.14 4.70±0.43理氣散結(jié)顆粒組 0.978 5 10 127.41±18.96 4.54±0.62理氣散結(jié)顆粒組 1.957 0 10 109.27±22.22 3.96±0.69#理氣散結(jié)顆粒組 3.914 0 11 132.81±23.62? 4.23±0.47#

圖2 各組大鼠乳腺組織ER蛋白表達(dá) （IHC，×400）Fig.2 ER protein expressions of rat mammary gland tissue in various groups（IHC， ×400）

圖3 各組大鼠乳腺組織PR蛋白表達(dá) （IHC，×400）Fig.3 PR protein expressions of rat mammary gland tissue in various groups（IHC， ×400）

表4 理氣散結(jié)顆粒對(duì)ER、PR蛋白表達(dá)的影響（Tab.4 Effects of Liqi Sanjie Granules on ER and PR protein expressions

表4 理氣散結(jié)顆粒對(duì)ER、PR蛋白表達(dá)的影響（Tab.4 Effects of Liqi Sanjie Granules on ER and PR protein expressions

注：與模型對(duì)照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 動(dòng)物數(shù)／只 ER平均光密度 PR平均光密度空白對(duì)照組 — 10 0.229 0±0.006 5? 0.219 3±0.002 4??模型對(duì)照組 — 12 0.239 5±0.003 1 0.232 3±0.001 7他莫昔芬組 0.003 3 9 0.236 2±0.004 0 0.225 0±0.005 0小金丸組 0.200 0 11 0.235 0±0.002 6? 0.221 2±0.008 7?理氣散結(jié)丸組 1.957 0 10 0.235 0±0.002 7? 0.227 9±0.003 2?理氣散結(jié)顆粒組 0.978 5 10 0.237 6±0.003 0 0.226 6±0.010 9理氣散結(jié)顆粒組 1.957 0 10 0.235 0±0.002 0? 0.226 2±0.005 0理氣散結(jié)顆粒組 3.914 0 11 0.234 0±0.003 4? 0.221 1±0.005 9??

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，雌激素、孕激素等性激素對(duì)乳腺發(fā)育及病理變化起著主導(dǎo)作用[13］。當(dāng)體內(nèi)雌激素水平絕對(duì)或相對(duì)增加，孕激素水平絕對(duì)或相對(duì)減少時(shí)[14］，乳腺組織將受到雌激素長(zhǎng)期刺激，導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管和小葉增生，同時(shí)促進(jìn)組織水、鈉潴留，進(jìn)一步引起小葉間質(zhì)水腫[15］，并且乳腺實(shí)質(zhì)由于缺乏孕激素調(diào)節(jié)和保護(hù)而增生過(guò)度和復(fù)舊不全，從而引起乳腺導(dǎo)管上皮和纖維組織不同程度的增生和末梢腺管或腺泡形成囊腫，乳腺增生即是以這種增生和復(fù)舊的紊亂為基礎(chǔ)[16-17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各劑量理氣散結(jié)顆粒對(duì)大鼠血清雌二醇 （E2）水平的影響與理氣散結(jié)丸相當(dāng)，但中、高劑量下降低孕酮（P）水平作用顯著強(qiáng)于后者。

研究顯示，雌激素受體 （ER）、孕激素受體（PR）過(guò)量表達(dá)可使乳腺增生、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展加劇，其中前者信號(hào)對(duì)乳腺生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞凋亡有調(diào)控效應(yīng)[8，18］。一般情況下，乳腺癌發(fā)展機(jī)制模式是 “正常→增生→非典型增生→原位癌→浸潤(rùn)性癌”[19］，由此可知非典型增生是癌變過(guò)程中的必經(jīng)階段。 目前， 多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[20］Wnt-2、 C-myc、ER、PR等因子與乳腺癌生長(zhǎng)、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時(shí)乳腺腔分泌細(xì)胞的持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生[21］。有報(bào)道指出，乳腺是雌孕激素的靶器官，雌孕激素受體ER、PR能與雌孕激素特異性結(jié)合，乳腺增生發(fā)生與雌孕激素及雌孕激素受體紊亂有密切關(guān)系[22］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中、高劑量理氣散結(jié)顆粒能顯著降低大鼠乳腺組織中ER蛋白表達(dá)，同時(shí)高劑量下還能顯著降低PR蛋白表達(dá)，與理氣散結(jié)丸作用相當(dāng)。

從乳腺組織病理學(xué)來(lái)看，理氣散結(jié)顆粒對(duì)大鼠乳腺組織增生有明顯治療作用，具體表現(xiàn)為部分大鼠乳腺組織無(wú)乳腺增生，其余乳腺小葉和腺泡數(shù)量降低，腺上皮細(xì)胞空泡變性、增生、脫落減少，無(wú)壞死，與理氣散結(jié)丸作用相當(dāng)。其中，低劑量下作用最明顯，其次為中、高劑量，其原因有待進(jìn)一步研究。

理氣散結(jié)顆粒是由大蜜丸理氣散結(jié)丸改變劑型所得，與原劑型相比不僅有保存藥效、質(zhì)量穩(wěn)定、服用量小的優(yōu)點(diǎn)，而且能更好、更廣泛地應(yīng)用于臨床，市場(chǎng)規(guī)模大，前景良好。中醫(yī)認(rèn)為，乳腺增生屬于 “乳癖”“乳中結(jié)核”范疇，理氣散結(jié)顆粒中柴胡疏肝解郁，為君藥；香附理氣疏肝，助柴胡疏肝解郁，與當(dāng)歸、川芎、延胡索同用，增加其活血行氣止痛之功效，共為臣藥；青皮理氣化滯，白芍、甘草養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，均為佐藥；蜂房、山慈姑消癰散結(jié)，與甘草調(diào)和諸藥同用，共為使藥，全方共奏疏肝解郁、活血行氣止痛之功效，從而治療乳癖。

綜上所述，理氣散結(jié)顆?？山档痛笫笕橄俳M織中ER、PR蛋白表達(dá)，減少與E2、P的特異性結(jié)合，從而緩解雌孕激素紊亂和乳腺增生，其機(jī)制可能與改善乳腺組織中ER、PR蛋白表達(dá)有關(guān)。