陳玉梅，黨偉華，劉燕凱，周景明，劉紅亮，郭亞楠，張改平，王愛萍

（鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450000）

藍(lán)舌病（Bluetongue，BT）是由藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）感染引起的，經(jīng)昆蟲傳播的一種疾病[1]，被我國列為一類動物疫病。目前尚未發(fā)現(xiàn)人類感染BTV的報道[2]。BTV主要感染牛、羊等反芻動物[3]，屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬 （Orbivirus）藍(lán)舌病病毒亞群（Bluetongue virus subgroup）?，F(xiàn)在報道的BTV有27種血清型，且每種血清型之間無交叉保護(hù)[4-7]。BTV基因組由大片段（L1～L3）、中片段（M4～M6）、小片段（S7～S10）組成，共編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP7）和4種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4）[8]。BTV有雙層蛋白衣殼結(jié)構(gòu)：VP2和VP5構(gòu)成外殼，VP3和VP7構(gòu)成內(nèi)殼[9]。VP2能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，而VP5能夠增強(qiáng)VP2產(chǎn)生中和抗體的能力，因此VP5可以用于病毒樣顆粒裝配和基因工程疫苗研究[10]。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了BTV-1型病毒的VP5蛋白，又對其免疫原性進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步研究VP5蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種PET-28a：鄭州大學(xué)分子免疫室保存；IPTG、氨芐青霉素、卡那霉素、Bradford蛋白濃度測定試劑盒：Solarbio公司產(chǎn)品；His單抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗：Abbkine公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒：TIANGEN公司產(chǎn)品。BamHI、XhoI、T4DNA連接酶、蛋白Marker、核酸Marker：由TaKaRa公司提供；BTV-1型滅活病毒：云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院捐贈。

1.2 方法

1.2.1 目的基因合成及引物設(shè)計 根據(jù)BTV-1 VP5蛋白在NCBI GenBank公布的序列（GenBank accession No.AGW27485.1），按照E.coli密碼子的偏愛性，優(yōu)化BTV-1 VP5蛋白基因序列，同時根據(jù)合成的VP5基因序列，設(shè)計VP5基因引物：VP5-F：AAGGATCCATGGGTAAAGTGATCCGCTCCCT；VP5-R：AACTCGAGTTAAGCGTTACGCAGGAACAGT。

1.2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 以VP5基因序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32 個循環(huán)；72 ℃ 10 min?；厥漳康钠危瑢P5和PET-28a分別用BamHI 和XhoI雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑單克隆培養(yǎng)，將陽性菌液送生物公司測序。

1.2.3 VP5重組蛋白表達(dá)及可溶性分析 轉(zhuǎn)化陽性重組質(zhì)粒至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆進(jìn)行培養(yǎng)；將陽性菌液1:100接種于50 mL Kan+抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.6時，加入0.2 mmol/L IPTG 25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，12 000 r/min離心誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液10 min；棄上清，用1 mL PBS重懸菌體并進(jìn)行超聲破碎（時間分別為10 min、3 s，間歇3 s，功率為45 w），12 000 r/min離心15 min；分離上清和沉淀，用SDS-PAGE、Western-blot分析蛋白可溶性。

1.2.4 VP5重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

1.2.4.1 培養(yǎng)基成分優(yōu)化 表達(dá)菌1:100分別接種于10 mL LB和2×YT培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.6時，加入0.2 mmol/L IPTG，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h；分別在0、2、4、6、8、10 h測菌體OD600nm，分析生長速率，用SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4.2 誘導(dǎo)劑IPTG濃度優(yōu)化 表達(dá)菌1:100接種于6瓶10 mL 2×YT培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.6時，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L IPTG，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h；分別在0、2、4、6、8、10 h測菌體OD600nm，分析生長速率，用SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4.3 誘導(dǎo)表達(dá)時間 表達(dá)菌1:100接種于6瓶10 mL 2×YT培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.6時，加入0.2 mmol/L IPTG，25 ℃分別誘導(dǎo)表達(dá)2、4、6、8、10 h，用SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4.4 金屬離子種類 表達(dá)菌1:100接種于5瓶10 mL 2×YT培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.6時，分別加入Ca2+、Fe3+、Mg2+、K+，在0.2 mmol/L IPTG 25 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)6 h；分別在0、2、4、6、8、10 h測菌體OD600nm，分析生長速率，用SDSPAGE分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4.5 誘導(dǎo)溫度 表達(dá)菌1:100接種于3瓶10 mL 2×YT培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.6時，加入0.2 mmol/L IPTG，分別在20、25、30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h，用SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 蛋白純化 取表達(dá)后的菌液100 mL，12 000 r/min 離心10 min，棄上清；用10 mL PBS重懸菌體，超聲破碎；將超聲后的上清液12 000 r/min 離心15 min，0.22 mm濾膜過濾后用鎳親和層析法純化，通過優(yōu)化平衡液（50 mmol/L Tris-HCl+300 mmol/L NaCl+咪唑）、洗滌液（50 mmol/L Tris-HCl+300 mmol/L NaCl+咪唑）和洗脫液（50 mmol/L Tris-HCl+300 mmol/L NaCl+咪唑）中咪唑的濃度，使其達(dá)到最好的純化效果，并用SDS-PAGE、Western-blot鑒定純化效果。

1.2.6 動物試驗(yàn) 將15只6～8周齡的Balb/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組5只。低劑量組，每只免疫20 mg的VP5蛋白；高劑量組，每只免疫40 mg的VP5蛋白；PBS免疫組，作為陰性對照。首免用完全佐劑和蛋白/PBS混合乳化，二免和三免均用不完全佐劑和蛋白/PBS混合乳化。每3周免疫1次，免疫后分別于0、7、14、21、28、35、42、49、56 d尾靜脈采血，用Dot-ELISA、間接ELISA評價免疫效果。

1.2.7 免疫效果初步評價

1.2.7.1 Dot-ELISA測定免疫血清與滅活BTV-1反應(yīng)性 將條狀NC膜在磷酸鹽緩沖液（PBS）中完全浸濕，室溫晾干；取1 mL滅活BTV-1點(diǎn)在膜上，再取1 mL VP5蛋白和1 mL PBS分別作為陽性對照和陰性對照，以1:500稀釋的陽性血清作為一抗，1:5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠作為二抗，采用AEC顯色，分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7.2 間接ELISA測定免疫血清效價 將純化的VP5蛋白作為包被原，以80 ng/孔的包被量包被96孔板，每孔50 mL，4 ℃包被過夜；第2天棄去包被液，用PBST洗滌3次，封閉，37 ℃孵育1 h；棄去封閉液，用PBST洗滌3次；測效價時，分別加入起始體積分?jǐn)?shù)為1:100的2倍倍比稀釋的免疫血清；抗體消長規(guī)律測試時，分別在0、7、14、21、28、35、42、49、56 d 加入 1:1 000 稀釋的免疫血清，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入1:5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠，37 ℃孵育1 h；用PBST洗滌3次，然后加入TMB顯色液，5 min后終止顯色；測OD450nm，評價免疫效果。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建

目的基因PCR結(jié)果顯示，有1條1 600 bp大小的條帶（圖1-A），與預(yù)期的VP5大小一致；雙酶切（圖1-B）鑒定顯示，插入的VP5 基因與預(yù)期相符，測序顯示基因序列正確，說明重組質(zhì)粒28a-VP5構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白初步表達(dá)及可溶性分析

將重組質(zhì)粒28a-VP5轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，初步誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE及Western-blot分析。結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)的對照菌相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌在約62 kDa處有1條明顯的蛋白條帶（圖2-A、圖2-B），與預(yù)期結(jié)果一致，說明目的蛋白成功表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)菌體經(jīng)超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果顯示，重組蛋白VP5主要以可溶形式表達(dá)（圖2-C）。

圖1 目的基因擴(kuò)增（A）和重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定（B）

2.3 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，2×YT培養(yǎng)基中E.coli菌體生長速率明顯比LB培養(yǎng)基快（圖3-A），IPTG濃度對E.coli菌體生長速率影響不大（圖3-B）；SDS-PAGE結(jié)果顯示，IPTG對目的蛋白的表達(dá)量影響也不顯著。因此，選擇最低的0.2 mmol/L為最佳IPTG濃度。隨誘導(dǎo)時間的延長，目的蛋白表達(dá)量明顯增加，6 h后目的蛋白表達(dá)量最高（圖3-C），而Ca2+、Fe3+、Mg2+、K+對E.coli菌體生長速率及目的蛋白表達(dá)量的影響均不顯著（圖3-D）；25 ℃時，目的蛋白可溶性表達(dá)量最高（圖3-E）?；谏鲜鰞?yōu)化結(jié)果，重組蛋白的最佳表達(dá)條件為：選擇2×YT培養(yǎng)基，在IPTG濃度為0.2 mmol/L時25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，目的蛋白表達(dá)量最高。

圖2 誘導(dǎo)表達(dá)的VP5蛋白SDS-PAGE（A）、Western-blot（B）、可溶性分析（C）

2.4 NI柱層析法純化VP5蛋白

通過優(yōu)化純化條件，用20 mmol/L咪唑的平衡液平衡柱子，40 mmol/L咪唑的洗滌液洗脫雜蛋白，250 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白。SDS-PAGE及Western Blot結(jié)果顯示，重組蛋白純化效果較好（圖4），純度約為75%。經(jīng)Bradford蛋白濃度測定，試劑盒測純化后的VP5蛋白質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1.42 mg/mL。

2.5 免疫效果初步評價

Dot ELISA結(jié)果顯示，在高劑量組，5只小鼠血清均能與BTV-1發(fā)生特異性反應(yīng)（圖5-A：a—e）；低劑量組中，有4只小鼠血清能與BTV-1發(fā)生特異性反應(yīng)（圖5-A：f—i），有1只小鼠反應(yīng)較弱（圖5-A：j）；而PBS免疫組小鼠血清均不與BTV-1發(fā)生反應(yīng)（圖5-A：k）。這說明E.coli重組表達(dá)的VP5蛋白免疫血清可以與BTV-1發(fā)生特異性反應(yīng)。用純化的VP5蛋白包板，ELISA測定血清效價。結(jié)果顯示，高、低劑量組均能產(chǎn)生針對VP5蛋白的較高效價的特異性抗體，抗體效價在 1:1.024×105～1:2.048×105之間（圖5-B），且隨著免疫時間的推移，兩組抗體滴度均呈現(xiàn)增長趨勢，而PBS對照組均無特異性抗體產(chǎn)生（圖5-C）。

圖3 重組蛋白VP5的表達(dá)條件優(yōu)化

圖4 純化后的VP5蛋白SDS-PAGE（A）及Western Blot鑒定（B）

3 討論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BTV-1 VP5蛋白。為了提高表達(dá)量，對培養(yǎng)基成分、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、金屬離子、誘導(dǎo)溫度等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳表達(dá)條件為： 2×YT培養(yǎng)基、IPTG濃度為0.2 mmol/L、25 ℃ 誘導(dǎo)6 h。此條件下的蛋白表達(dá)量最高，金屬離子對表達(dá)量影響不大。

BTV外層衣殼由VP2和VP5構(gòu)成，有研究表明，VP5能增強(qiáng)VP2中和抗體的產(chǎn)生[10]。也有研究表明VP2雖然能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但不能對機(jī)體提供完全有效的保護(hù)，而VP5的添加能夠明顯增強(qiáng)VP2的保護(hù)作用，這可能是兩者協(xié)同作用的緣故，也可能是VP5改變了VP2的空間構(gòu)像[11]。因此，VP5的研究對BTV疫苗的研制具有重要意義。

圖5 Dot ELISA結(jié)果（A）、血清效價（B）和抗體消長規(guī)律（C）

有研究用帶有MBP標(biāo)簽表達(dá)的BTV-12 VP5蛋白，獲得了約112.2 kDa的MBP-VP5蛋白，但其抗原性不太好，在5份山羊血清中只有1份為陽性[11]。天然的BTV-1 VP5蛋白大小約為59.2 kDa。而本試驗(yàn)選用His標(biāo)簽融合表達(dá)BTV-1 VP5蛋白，獲得的重組蛋白His-VP5大小約為62 kDa，與預(yù)期一致。通過免疫Balb/c小鼠獲得免疫血清，經(jīng)Dot-ELISA證實(shí)，重組BTV-1與重組蛋白His-VP5免疫的陽性血清均能發(fā)生特異性反應(yīng)；ELISA結(jié)果顯示，高、低劑量組VP5免疫均能產(chǎn)生針對VP5蛋白的高效價特異性抗體，效價范圍為1:1.024×105～1:2.048×105，而 PBS 免疫的陰性對照組均無特異性抗體產(chǎn)生，說明本試驗(yàn)獲得的重組VP5蛋白具有良好的免疫原性。這可能是由于His-標(biāo)簽分子量小，在pH8.0時不帶電，且無免疫原性，對蛋白質(zhì)的分泌、折疊功能基本無影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對VP5蛋白自身結(jié)構(gòu)的影響也不大，與之前的研究相一致[12]。

4 結(jié)論

本研究經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了BTV-1 VP5蛋白。該蛋白的免疫血清能夠與BTV-1滅活病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有較好的免疫原性，這為開展BTV-1 VP5蛋白相關(guān)研究工作奠定了基礎(chǔ)。