藏 林，封 巖，門 磊，仇雪梅，王秀利

(1.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023；2.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)隸屬于鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方鲀屬(Takifugu)。它是幾種重要的海水養(yǎng)殖經濟魚類之一，由于其肉質細膩、肉味鮮美，魚肉中有含量極高的蛋白質，魚皮含有豐富的膠原蛋白，已在中國、韓國及日本等亞洲國家廣泛培育[1]。

野生河豚常含有致命的毒性河豚毒素(TTX)，尤其是在雌魚的卵巢中[2]。河豚毒素是一種極為有效的神經毒素，它特異性地與肌肉和神經組織中的電壓門控鈉通道結合，并阻斷鈉離子通道進入神經元[3-5]。野生河豚通常通過食物鏈對毒素進行生物累積，在特定組織(如肝臟、卵巢和皮膚)中產生大量的河豚毒素[6]。當喂食含河豚毒素的食物時，無毒人工培養(yǎng)的河豚魚的肝臟、卵巢和皮膚中都高水平積累了河豚毒素[7-8]。這種河豚毒素最有可能通過飲食口服，然后從腸道吸收，通過血液循環(huán)分配，并運輸到肝臟[9-10]。在雌性河豚魚的肝臟中有一部分河豚毒素在成熟期被轉運到了卵巢中。有研究表明人工經靜脈注入河豚毒素時，河豚毒素在肝臟中的含量明顯隨著河豚毒素注射量的增加而增加，這表明河豚毒素存儲在肝臟中是毒化紅鰭東方鲀的第一個步驟[11]。

卵黃蛋白原( Vitellogenin，Vtg)是卵黃蛋白(Yolk protein)的前體，存在于幾乎所有卵生物種的雌性中，包括魚類、兩棲動物、爬行動物、鳥類，以及大多數無脊椎動物。Vtg主要是在肝臟中的雌激素17β-雌二醇的刺激下產生，通過體循環(huán)分布全身，并隨血液循環(huán)系統(tǒng)進入到卵巢。在進入卵巢的過程中，特異性受體錨定在卵母細胞質膜并與卵黃蛋白原結合，并成為與他們的卵黃蛋白原內化的配體。 Ikeda在日本長崎縣使用處于成熟期的野生河豚魚，在測得促性腺激素指數(GSI)增加的情況下，卵巢中的毒性也隨之增加，而同時肝臟毒性顯著下降[12]。卵黃蛋白原儲存在早期卵母細胞體內，然后裂解成脂質細胞(I和II)，卵黃蛋白和vWF D型結構域[13-14]。卵黃蛋白原除了有卵黃蛋白的前體的作用外，卵黃生成素還可作為金屬、無機磷酸鹽、脂質和碳水化合物的載體蛋白[15-16]。

實時定量PCR(real-time fluorescence-quantitative PCR，qPCR)是一種具有高靈敏度、可重復性的基因表達譜分析技術。作為最靈敏、精確、可重復的定量特異RNA的技術之一，它現在被廣泛應用于各個領域，并成為驗證微陣列和RNA-seq數據的最常用方法[17-19]。

本文應用實時定量PCR的方法，擬獲得紅鰭東方鲀Vtg基因基于qPCR表達分析的相關引物，為今后分析紅鰭東方鲀的 Vtg基因的表達譜、深入探討河豚毒素在肝臟和卵巢中富集與分布奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用18月齡的紅鰭東方鲀50尾，采自大連天正實業(yè)有限公司。麻醉后，采集新鮮的紅鰭東方鲀肝臟和尾鰭組織，立即儲存在液氮中，然后在-80 ℃的超低溫冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 性別鑒定 將上述50尾紅鰭東方鲀解剖，根據性腺發(fā)育的程度、形狀和顏色進行性別鑒定，具體鑒別方法按照參考文獻20、21的方法進行。

1.2.2 總RNA的提取 隨機取15尾雌性紅鰭東方鲀等量大小的肝臟組織樣品，置于有液氮的研缽中進行研磨，直至呈粉末狀，混合后用于總RNA的提取。按照RNAiso plus(Takara Biotechnology (Dalian) Co.,Ltd.)的說明書進行總RNA提取，具體步驟如下：取研磨后的粉末狀混合物50～100 mg于離心管中，加入1 mL的 RNAiso plus，室溫靜置10 min，12 000 r/ min，4 ℃離心15 min，取上清移至1.5 mL離心管中；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩混勻至呈乳白色，室溫靜置10 min，12 000 r/ min，4 ℃離心15 min，取約400 μL上清轉移至新離心管中；加入等體積約400 μL異丙醇，緩慢顛倒混勻10次，于-20 ℃條件中靜置20 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，棄去上清留沉淀部分；加入1 mL的75%現配乙醇，于12 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄乙醇保留沉淀，重復兩次；得到的沉淀物在無酶環(huán)境下進行沉淀干燥2～5 min后，溶于 DEPC水中，暫存于4 ℃冰箱中使其充分溶解后，保存于-80 ℃超低溫冰箱留用。用超微量分光光度計Aligent2000對溶解完全后的RNA進行波長長度為260 mm和280 mm的濃度及純度分析；隨后對其進行1%的普通瓊脂糖凝膠、恒壓電泳分離系統(tǒng)進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)初步測定提取的總RNA完整性進行觀察與拍照。

1.2.3 cDNA第一條鏈的合成 選取 OD260/OD280在1.8～2.0之間的 RNA作為反轉錄的模板，根據逆轉錄試劑盒(Takara Biotechnology (Dalian) Co.,Ltd.)的說明書進行逆轉錄反應。具體反應體系如下： 2 μL 5×PrimeScript Buffer、0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、0.5 μL Oligo dT primer、0.5 μL Random6 mers、3 μL模板和3.5 μL RNase free H2O。 反應條件： 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.2.4 引物設計及常規(guī)PCR的篩選 下載紅鰭東方鲀卵黃蛋白原Vtg-1的基因序列(GenBank號：XM_011614929.1)，利用Primer5.0設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

取雌性紅鰭東方鲀肝臟的cDNA 進行常規(guī)PCR擴增Vtg-1基因片段。擴增總體積為25 μ L，其中上下游引物各0.5 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶0.4 μL， ddH2O 18.1 μL，cDNA模板1 μL。擴增條件為：94 ℃，5 min預變性；94 ℃，30 s變性； 8 ℃，30 s退火； 72 ℃，30 s延伸，35個總循環(huán)。PCR產物經1%的普通瓊脂糖凝膠和恒壓電泳分離系統(tǒng)上進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)初步測定提取的總RNA完整性進行觀察與拍照。對得到的Vtg-1基因的單個擴增產物進行測序，并通過NCBI BLAST程序在線比較和驗證測序結果。

1.2.5 qPCR引物的設計與評估 根據測序后獲得的Vtg-1基因序列獲得的qPCR擴增的引物設計原理，使用Primer5.0設計引物，并在常規(guī)PCR檢測后進行qPCR擴增。

標準曲線的制備：以逆轉錄后的cDNA原液為模板，采用5點10倍稀釋法進行實時定量PCR實驗。 實驗在ABI Step One Plus實時定量PCR儀上利用全式金TransStart?TopGreen qPCR SuperMix 的試劑盒進行qPCR反應。反應體系為 20 μL：其中包括 MIX Buffer 10 μL，Dye 0.4 μL，RNAse Free ddH2O 7.4 μL，正反向引物濃度為10 μm/ L各0.6 μL和模板1 μL，每個樣品3次重復，反應條件為：94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；58 ℃，15 s；72 ℃，25 s；40個循環(huán)。 觀察熔解曲線及標準曲線，確定Ct值。擴增體系條件與標準曲線的制備條件相同，取上述 cDNA 為模板，進行qPCR定量實驗。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測

紅鰭東方鲀肝組織的總RNA顯示28 s rRNA和18 s rRNA的條帶亮度比在1和2之間(圖1)， OD260/OD280均在1.8～2.0之間。

2.2 常規(guī)PCR引物設計、篩選及驗證

根據紅鰭東方鲀卵黃蛋白原 Vtg-1的基因序列( XM_011614929.1)，利用軟件 Primer5.0設計引物，篩選出了兩對適宜進行PCR擴增的引物(表1)。

圖1 紅鰭東方鲀肝臟組織的總RNA電泳圖

引物名稱引物序列(5’-3’)擴增產物大小(理論值)/bpTm/℃擴增產物名稱Vtg-1F1TTGGCAGCTCTGGAGTTCCT31859.7VtgF1-VtgR1Vtg-1R1GGGCATCGGGTATTTCGTTC61.7Vtg-1F2 ATGGACAAACCCACGAACAG23457.9VtgF2-VtgR2Vtg-1R2AAGGGCATCGGGTATTTCGT61.0

圖2 常規(guī)PCR擴增產物的電泳結果注：泳道M：DNA分子標量；泳道1～2：由引物對VtgF1-VtgR1擴增的Vtg基因的PCR產物；泳道3～4：由引物對VtgF2-VtgR2擴增的Vtg基因的PCR產物

將紅鰭東方鲀肝臟組織的cDNA用作模板，對表1中所示的兩對引物進行常規(guī)PCR擴增篩選。如圖2所示，引物VtgF1-VtgR1的擴增產物僅具有約320 bp的一條擴增條帶(泳道1、2)；引物 VtgF2- VtgR2的擴增產物在240 bp處有清晰的一個擴增條，但在小于100 pb處有較為明顯引物帶，根據引物設計原則，判斷為引物二聚體，不適合表達分析(泳道3、4)。

對上述擴增后所得到的產物Vtg-1進行測序，得到長度為316 bp的序列。將獲得的序列進行GenBank BLAST在線比對，結果顯示：與已報報道的紅鰭東方鲀Vtg-1基因(序列號： XM_011614929.1)相比，本研究測序所得的由引物對VtgF1-VtgR1擴增的PCR產物序列的與Vtg-1基因的源性可達99%(圖3)。

圖3 由引物對VtgF1-VtgR1擴增的PCR產物序列與Vtg-1基因序列的BLAST對比結果

2.3 qPCR引物的設計與評估

2.3.1 qPCR引物的設計 在常規(guī)PCR擴增引物的篩選中，由引物對VtgF1-VtgR1的擴增產物僅具有一個擴增條帶，沒有非特異性擴增。但在測序后，擴增條帶大小為316 bp。該對引物不太適用于 qPCR擴增實驗。 根據得到的由引物對VtgF1-VtgR1擴增的PCR產物序列再設計一對較適于qPCR擴增反應的引物：VtgF-VtgR，擴增片段大小約133 bp(表2)。

表2 擬用于qPCR擴增的引物序列信息

2.3.2 引物的qPCR評估 根據qPCR擴增反應的引物對VtgF-VtgR的Tm值，進行退火溫度為55 ℃、58 ℃和60 ℃這3個溫度下的qPCR擴增。結果顯示qPCR擴增的Ct值在58 ℃的退火溫度下最小(表3)。 因此在退火溫度為58 ℃時，進行引物VtgF-VtgR的qPCR擴增最為適宜。

采用引物對VtgF-VtgR在58 ℃作為退火溫度，應用10倍稀釋法進行cDNA模板樣品的實時定量PCR擴增。根據結果顯示：在指數擴增區(qū)域中彼此相鄰的擴增曲線均勻隔開(圖4-A)，并且每個反應的熔解曲線在Tm處為82.72是單個尖峰(圖4-B)，并且該引物標準曲線的擴增效率為105.32%，標準曲線的相關系數R2值為0.999(圖4-C)。

表3 引物VtgF-VtgR在不同退火溫度下進行qPCR擴增時得到的Ct值

圖4 引物對VtgF-VtgR qPCR的擴增曲線

3 討論

當使用實時定量qPCR通過基因表達譜分析技術對靶基因表達時，提取的總RNA的完整性和純度是影響擴增效率的最基本因素。如果提取的總RNA質量差或被污染，則產生的數據會有偏差，導致結果不準確。當提取的RNA樣本通過瓊脂糖電泳分析時，電泳圖上有明顯的兩條帶28 s和18 s帶，并且28 s/18 s rRNA的帶亮度比在1和2之間，表明其具有良好的完整性。通過測定，本研究得到的總RNA的OD260/OD280比值在1.8和2.0之間，表示RNA樣品純度高，不含蛋白質和其他雜質，滿足實時定量PCR對總RNA的要求。

所設計引物的序列對PCR擴增反應的特異性以及擴增效率至關重要。普通 PCR擴增的引物一般長度在15～30個堿基之間最好，GC含量為50%～60%。此外，上游和下游引物的GC含量不應太大，Tm為55～65 ℃之間，引物自身和引物間不應存在互補序列，從而避免產生發(fā)夾結構和引物二聚體。對于qPCR擴增，擴增片段的長度優(yōu)選為80～250 bp，最合適的長度約在150 bp左右。 本研究基于已公布的紅鰭東方鲀卵黃蛋白原Vtg-1的基因序列信息(GenBank號： XM_011614929.1)，設計出兩對引物，即：VtgF1-VtgR1和VtgF2-VtgR2，所得到擴增出的序列大小分別為320 bp和240 bp。在常規(guī)PCR中，引物對VtgF1-VtgR1的擴增片段大小約為320 bp，這與理論值一致，并且擴增產物沒有雜質帶。與第一對引物相比，引物對VtgF2-VtgR2的擴增產物除了主帶之外還具有一條引物帶。第一對引物具有很強的擴增特異性，但其擴增片段的大小不符合qPCR擴增的最佳要求。因此，本研究對引物對VtgF1-VtgR1擴增出的產物序列進行重新設計得到適用于實時定量PCR的引物：VtgF-VtgR，擴增片段大小約為133 bp，與理論值大小相一致，因此可以通過實時定量PCR對引物對VtgF-VtgR進行進一步評估。

在進行實時定量PCR的過程中，設置了陰性對照，且陰性對照無擴增信號；對于每個擴增樣品濃度設定三個生物學重復，并且這些重復樣品的Ct值的標準偏差應小于0.5，否則結果將是不可靠的并且需要重新擴增。在該實驗中，陰性對照顯示沒有擴增信號，并且擴增樣品值的標準偏差小于0.5，這證明了測試數據的可靠性。

退火溫度的高低直接影響 PCR結果的好壞，不適宜的退火溫度會導致引物非特異性的擴增或者會形成引物二聚體，因此在實驗中，要對退火溫度進行優(yōu)化[22]。引物擴增的特異性在進行實時定量PCR實驗中起關鍵性作用，在進行退火溫度優(yōu)化的同時要進行熔解曲線的分析，以此判斷引物擴增的特異性[23]。如果獲得的熔解曲線是單峰，則表明引物擴增具有特異性；相反，如果在熔解曲線上不僅存在一個波峰，則表明該引物有非特異性的擴增。依據本實驗引物的 Tm值的結果顯示，當退火溫度為58 ℃時，該引物擴增的 Ct值最小，有且只有一個波峰。因此，58 ℃的退火溫度是本實驗較適合于qPCR分析的。

除擴增特異性外，引物應具有良好的擴增效率，以便最終用于實驗樣本的實時定量PCR的分析。擴增效率一般可通過對按照十倍比稀釋的c DNA模板進行定量分析建立的標準曲線來確定。優(yōu)化后的結果有以下特點：1、標準曲線的決定系數R2>0.980；2、高擴增效率，即擴增效率在90%～105%；3、具有一致的重復反應。遞減的直線關系等式和標準曲線的決定系數R2常常被用來判斷反應條件是否優(yōu)化。擴增效率接近100%是優(yōu)化的重復性好的實驗的最好標志，在實際操作時，反應擴增效率應在90%～105%之間[24]，如果擴增效率低，可能的原因是引物設計的不當，或者是反應條件未優(yōu)化；擴增效率過高，可能的原因是系列稀釋樣品加樣錯誤，或者有非特異性擴增，如引物二聚體[25]。此次實驗引物 VtgF-VtgR的標準曲線分析顯示：引物的擴增效率為105.32%，R2值為 0.999；定量結果表明，當進行擴增時，熔解曲線是單峰值。上述結果說明，該對引物具有良好的擴增特異性和擴增效率，滿足了實時定量PCR擴增的要求。

通過引物對 VtgF-VtgR的退火溫度優(yōu)化和標準曲線的建立，結果表明，該對引物適用于紅鰭東方鲀 Vtg基因的實時定量PCR分析。本研究結果為紅鰭東方鲀Vtg基因的組織表達譜分析及不同發(fā)育階段的定量表達分析奠定了基礎。