楊丁丁，姚 鑫

(中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院，北京 100049)

近年來，越來越多的納米材料被發(fā)現(xiàn)具有類酶活性，并且類酶活性的研究也取得了很大的進(jìn)展。在各種納米材料中，納米CeO2因其表面存在Ce3+/Ce4+的自動再生循環(huán)而成為一種多功能的納米酶，受到人們廣泛關(guān)注。目前為止，納米CeO2被報導(dǎo)具有過氧化氫酶活性[1]、過氧化物酶活性[2]、超氧化物歧化酶活性[3]、氧化酶活性[4]、磷酸三酯酶活性[5]等，因此納米CeO2既可以用作還原型催化劑，又可以用作氧化型催化劑。類酶的催化反應(yīng)通常發(fā)生在納米粒子表面，所以由于納米CeO2的表面修飾而導(dǎo)致的材料表面化學(xué)的任何變化都可以改變納米CeO2與底物之間的相互作用，從而改變納米CeO2的催化活性，因此研究表面修飾對其類酶活性的影響至關(guān)重要。先前的研究也表明氟離子[6]、硫酸根離子[7]、聚合物[4]、蛋白質(zhì)[8]等都可以改變納米CeO2的類氧化酶活性。在多種形貌的納米CeO2中，納米線由于長徑比較高，比表面積較大而容易被各種分子修飾。DNA作為一種重要的生物納米技術(shù)的核心分子被廣泛用于各種納米材料的修飾。在此，我們研究DNA對納米CeO2線類氧化酶活性的影響。

首先用水熱法合成納米CeO2線，使用X射線衍射儀(XRD)、透射電子顯微鏡(TEM)和拉曼光譜儀對其進(jìn)行表征。用傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜和紫外可見(UV-Vis)光譜研究DNA與納米CeO2線的相互作用。然后以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為探針研究DNA對納米CeO2線類氧化酶活性的影響。并且進(jìn)行pH影響及特異性實驗研究。

1 實驗部分

1.1 原料和儀器

小牛胸腺DNA，胃蛋白酶1∶3000(Solarbio)，含有20個堿基的單鏈DNA(Sangon Biotechnology Co.，Ltd中國上海)，DNA序列為5′-ATCATCGCCTACCTACGACT-3′。Ce(NO3)3·6H2O，CH3COONa和六亞甲基四胺(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。 CH3COOCH3CH3和CH3CH2OH(北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司)。2, 2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，酯酶，葡萄糖氧化酶以及 NaOH(Sigma Aldrich，UK)。透明質(zhì)酸酶(北京百靈威科技有限公司)。纖維素酶(來自黑曲霉，東京化成工業(yè)株式會社)。所有的化學(xué)品都為分析純的，不需要進(jìn)一步純化。實驗中所用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

透射電子顯微鏡(TEM，F(xiàn)EI Tecnai G2)；X射線衍射儀(XRD，Rigaku smartlab)；拉曼光譜儀(Renishaw in Via)；紫外可見分光光度計(AOE UV-560)；傅里葉變換紅外光譜儀(VERTEX 70)；冷凍干燥機(FD-1 A-80)；振蕩器(IKA M3 digital)。

1.2 納米CeO2線的合成與表征

采用水熱法合成納米CeO2線[9]。首先，在攪拌條件下，迅速將40 mL六水合硝酸鈰(0.05 mol/L)加入到40 mL NaOH(10 mol/L)中。攪拌約20 min后，將懸濁液轉(zhuǎn)移至高壓釜(100 mL)中并逐漸加熱至373 K并在此溫度下反應(yīng)24 h。冷卻至室溫，將反應(yīng)后的溶液離心并洗滌。最后將沉淀物在353 K條件下干燥過夜后得到CeO2納米線。將合成的納米CeO2線進(jìn)行透射電子顯微鏡，X射線衍射以及拉曼光譜表征。

1.3 紫外可見吸收光譜實驗

將DNA溶解于一定體積的10 mmol/L的乙酸鈉緩沖液中，配置成10 mmol/L的DNA溶液。ABTS溶解于水中也配成10 mmol/L。取一定量的納米CeO2線粉末分散于水中，攪拌，超聲制成5 mmol/L的CeO2納米線懸濁液。使用前將懸濁液稀釋10倍并且超聲30 min。實驗時，首先在10 mmol/L，pH 4.0乙酸鈉緩沖液中加入100 μL的納米CeO2線懸濁液，然后向溶液中加入不同體積的DNA溶液，立即將混合溶液震蕩0.5 h以確保DNA盡可能多地吸附在納米CeO2線上(DNA/CeO2)。最后，向混合溶液中加入100 μL的ABTS溶液。最終1 mL的混合溶液中含有50 μmol/L的納米CeO2線、不同濃度的DNA以及1 mmol/L的ABTS。將此混合溶液繼續(xù)震蕩1 h,測量反應(yīng)后溶液的紫外可見吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米CeO2線的表征分析

圖1 納米CeO2線的表征Fig.1 Characterization of CeO2 nanowires

圖1(a)為XRD表征，圖中的衍射峰依次對應(yīng)于(111)、(200)、(220)、(311)、(222)以及(400)晶面，表明樣品為典型的CeO2的螢石立方結(jié)構(gòu)(JSPDS card：34-0394)。圖1(b)是TEM表征，從圖中可以看出CeO2呈現(xiàn)良好的線狀結(jié)構(gòu)，并且測量結(jié)果CeO2平均直徑約7 nm，平均長度約140 nm，表明成功合成了納米CeO2線。圖1(c)為納米CeO2的拉曼光譜表征，從圖中可以看出在462 cm-1處出現(xiàn)強峰，這是螢石立方結(jié)構(gòu)的F2g振動模式，源于Ce-8O的對稱伸縮振動；在595 cm-1處產(chǎn)生拉曼吸收，這是納米CeO2的氧空位的特征峰[10]。這些表征結(jié)果證明了螢石立方結(jié)構(gòu)的納米CeO2線的成功合成。

2.2 DNA/CeO2的UV-Vis及FT-IR光譜分析

為探究納米CeO2線與DNA之間的相互作用，納米CeO2線與DNA作用后的溶液進(jìn)行離心處理，上清液及沉淀物分別進(jìn)行UV-Vis光譜(圖2(a))和FT-IR光譜(圖2(b))分析。 DNA能夠在260 nm處產(chǎn)生紫外吸收(曲線A)，與納米CeO2線作用后，其上清液的紫外吸收下降(曲線B)，表明DNA與納米CeO2線之間發(fā)生了相互作用，一定量的DNA被納米CeO2線吸附。納米CeO2線與DNA作用后，經(jīng)過離心、洗滌以及干燥處理后測定其紅外光譜(曲線C)。曲線A和B分別為小牛胸腺DNA與納米CeO2線的紅外光譜。對比B、C曲線可以看出，納米CeO2線在1 070 cm-1處紅外吸收峰增強，表明DNA吸附在納米CeO2線上。納米CeO2線在1 200～1 600 cm-1之間Ce-O伸縮振動峰[11]減弱，表明DNA吸附在納米CeO2線表面后，使納米CeO2線的紅外吸收峰發(fā)生變化。

(a)中實線A為DNA溶液，點線B為納米CeO2線與DNA相互作用后的上清液；(b)中實線B為納米CeO2線， 點線C為與DNA作用后的納米CeO2線，實線與點線間隔的線A為小牛胸腺DNA。圖2 納米CeO2線與DNA相互作用前后，溶液中DNA的UV-Vis以及納米CeO2線的FT-IR分析Fig.2 UV-Vis absorption spectra of DNA in solution and FT-IR analysis of CeO2 nanowires, before and after interaction of CeO2 nanowires with DNA

2.3 DNA對納米CeO2線氧化酶活性的影響

納米CeO2線具有類氧化酶活性，能將ABTS溶液由無色氧化為綠色，在417 nm處產(chǎn)生紫外吸收[12]。如果DNA的吸附能改變納米CeO2的類氧化酶活性，那么417 nm處的紫外吸收就會發(fā)生改變，由此可以判斷出DNA對納米CeO2線類氧化酶活性的影響，實驗結(jié)果如圖3所示。曲線A為1 mmol/L的ABTS的紫外吸收光譜，曲線B為50 μmol/L的納米CeO2線與1 mmol/L的ABTS作用后混合溶液的紫外吸收光譜，通過對比可以看出納米CeO2線與ABTS作用后的溶液紫外吸收上升，表明納米CeO2線能夠氧化ABTS，具有較強的氧化酶活性。曲線C為與0.01 μmol/L的DNA作用后的納米CeO2線氧化ABTS的紫外吸收光譜，從圖中可以看出與DNA作用后，DNA修飾的納米CeO2線氧化ABTS的紫外吸收下降，表明DNA抑制納米CeO2線的類氧化酶活性，并且隨著DNA濃度的逐漸增加，被氧化的ABTS的紫外吸收逐漸下降(曲線D-I)，表明隨著DNA濃度的增加，越來越多的DNA吸附在納米CeO2線上；吸附的DNA越多，對納米CeO2線的抑制作用越強。這些結(jié)果表明DNA能夠抑制納米CeO2線的類氧化酶活性。有報道指出鈰是一種硬金屬，磷酸根是一種硬配體，它們之間存在較強的配位能力[13]，從而導(dǎo)致DNA能夠通過磷酸鹽骨架與Ce發(fā)生相互作用吸附在納米CeO2的表面，紫外與紅外的結(jié)果也證明了二者的相互作用。另外也有研究表明磷酸鹽能與鈰離子發(fā)生相互作用從而改變納米CeO2的催化活性[14-15]。所以DNA中的磷酸根可能會影響Ce3+?Ce4+之間的循環(huán)，從而抑制納米CeO2線的類氧化酶活性。

(a)為不同濃度的DNA修飾的納米CeO2線催化ABTS氧化的吸收光譜曲線，各曲線中對應(yīng)的DNA的濃度分別為:

2.4 pH對DNA/CeO2氧化酶活性的影響

DNA對納米CeO2線氧化酶活性的影響研究是在pH為4.0濃度為10 mmol/L的乙酸鈉緩沖液中進(jìn)行的。為了研究pH對DNA修飾的納米CeO2線氧化酶活性的影響，我們在pH為3.0～5.0，濃度均為10 mmol/L的乙酸鈉緩沖液條件下，探究50 μmol/L的納米CeO2線與1.00 μmol/L的DNA相互作用對納米CeO2線氧化酶活性的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，pH越小，納米CeO2線氧化ABTS后溶液的紫外吸光度值越大，說明納米CeO2線的氧化酶活性也越高，這與之前的報導(dǎo)[4]也是一致的。另外，pH越小，1.00 μmol/L的DNA修飾的納米CeO2線氧化ABTS后溶液的紫外吸收下降得越多，說明DNA使納米CeO2線氧化酶活性下降越多。這些結(jié)果表明pH越小，DNA對納米CeO2線氧化酶活性影響越大。當(dāng)pH為3.0時，DNA對納米CeO2線氧化酶活性影響最大。而當(dāng)pH達(dá)到4.5以后，DNA對納米CeO2線氧化酶活性的影響變化已經(jīng)很小。但是，從圖中還可以看出，當(dāng)pH小于4.0 時，ABTS自身吸光度值逐漸上升，并且pH越小，ABTS溶液的吸光度越大，由此可知，ABTS在pH小于4.0的條件下是不穩(wěn)定的。因此，研究DNA對納米CeO2線氧化酶活性影響的最佳pH選為4.0。

圖4 納米CeO2線或DNA 修飾的納米CeO2線催化 ABTS氧化在417 nm處的吸光度值隨pH的變化Fig.4 Variation in the absorbance at 417 nm of ABTS oxidation catalyzed by CeO2 nanowires or DNA modified CeO2 nanowires with the pH value

2.5 特異性實驗

為了探究DNA分子對CeO2納米線氧化酶活性的影響是否具有特異性，我們選擇濃度為0.006 mg/mL的葡萄糖氧化酶、透明質(zhì)酸酶、胃蛋白酶、纖維素酶和酯酶分別與相同濃度的DNA分子同時加入到納米CeO2線中以研究CeO2納米線的氧化酶活性(圖5)。從圖中可以看出，這幾種酶的加入沒有影響DNA/CeO2氧化ABTS的能力，也就是說沒有干擾DNA對CeO2納米線氧化酶活性的影響，這說明DNA中磷酸鹽骨架與CeO2表面的Ce的相互作用比較強，從而避免其他生物分子對其的干擾，也表明DNA分子對納米CeO2線氧化酶活性的影響具有特異性。

圖5 其他酶干擾條件下，DNA對納米CeO2線催化 氧化ABTS在417 nm處的紫外吸光度值的影響Fig.5 Effect of DNA on the absorbance at 417 nm of ABTS oxidation catalyzed by CeO2 nanowires under other enzyme interference

3 總結(jié)

本文通過水熱法成功合成納米CeO2線，研究DNA修飾對其類氧化酶活性的影響。結(jié)果表明DNA能夠抑制納米CeO2線的類氧化酶活性，并且DNA的濃度越高，抑制作用越明顯，另外這種抑制作用具有特異性。這是因為DNA上具有能與Ce3+作用的磷酸鹽骨架，二者之間的相互作用影響Ce3+?Ce4+之間的循環(huán)，從而抑制納米CeO2線的類氧化酶活性。此結(jié)果能幫助我們更好地理解生物分子對納米CeO2的催化活性的影響，促進(jìn)納米CeO2線的實際應(yīng)用。