劉穎沙， 劉小寧， 李國(guó)秀， 劉 偉， 時(shí) 靜， 孫 進(jìn)， 鐘 陽(yáng)

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

紙色譜法是以濾紙為支持物的層析技術(shù)，濾紙纖維上分布大量的親水性羥基，因此與水親和力強(qiáng)，與有機(jī)溶劑親和力弱，所以在展層時(shí)，水是固定相，有機(jī)溶劑是流動(dòng)相，由于溶質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同，不同的氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率就不同，于是將這些氨基酸分離開(kāi)來(lái)，形成距原點(diǎn)距離不同的色譜點(diǎn)，各物質(zhì)分配系數(shù)相差越大，則越容易分開(kāi)。樣品被分離后在紙色譜圖譜上的位置，常用比移值Rf(Rf=原點(diǎn)到色譜點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離)表示，在一定條件下(如溫度、展開(kāi)劑的組成、色譜紙質(zhì)量等不變)，某物質(zhì)的Rf是定值，可作為定性分析的依據(jù)。紙色譜分離技術(shù)廣泛應(yīng)用于氨基酸、蛋白質(zhì)、染料、色素和中草藥等物質(zhì)的分離和鑒定，其操作簡(jiǎn)便，樣品用量小，既可以用作實(shí)驗(yàn)室的定性分離，也可用于工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)品的分析制備，現(xiàn)已成為生物化學(xué)和生物工程等學(xué)科必不可少的分析工具之一。在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)專業(yè)的《食品生物化學(xué)》課程中“氨基酸的紙色譜”是學(xué)生重要的實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)內(nèi)容[1]，但是如果按照課本步驟操作：首先，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法在4學(xué)時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)；其次，用微量注射器或者毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣的方式受人為因素干擾，組間結(jié)果差異較大；第三，濾紙易受污染，用濾紙作為惰性支持物容易影響最后分離效果；第四，展開(kāi)劑展開(kāi)速度較慢且有刺激性氣味；第五，用噴霧器噴顯色劑(茚三酮溶液)，噴出量和均勻性無(wú)法把握，容易污染學(xué)生的實(shí)訓(xùn)服。為改善實(shí)驗(yàn)方法，本文對(duì)“氨基酸的紙色譜”實(shí)驗(yàn)的固定相、展開(kāi)劑、點(diǎn)樣方式和顯色方式進(jìn)行優(yōu)化[2-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

色譜濾紙(新華一號(hào)濾紙)、薄層板、剪刀、層析缸(燒杯500 mL)、培養(yǎng)皿、吹風(fēng)機(jī)、微量注射器(5 uL)或毛細(xì)管、移液槍(5uL)、噴霧器、尺子和鉛筆、鑷子、封口膜。

1.2 試劑

(1)0.5%的氨基酸溶液(亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、纈氨酸)，各種試劑均為分析純。

(2)展開(kāi)劑(100 mL)。

1號(hào)：V(正丁醇)：V(冰醋酸)=4∶1；

2號(hào)：V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2；

3號(hào)：V(正丁醇)：V(冰醋酸)：V(乙醇)：V(水)=4∶1∶1∶2；

4號(hào)：V(95%乙醇)：V(水)=7∶3。

1.3 顯色方式

傳統(tǒng)方法，展開(kāi)完成之后用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮溶液進(jìn)行顯色；改進(jìn)方法,100 mg茚三酮加入配置好的展開(kāi)劑。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 點(diǎn)樣方式與展開(kāi)劑的優(yōu)化[7，8]

(1)濾紙。取濾紙1張(22×14 cm)。

(2)點(diǎn)樣。距一端2 cm處用鉛筆輕輕的劃線，然后在線上分別用0.5%的亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和纈氨酸均勻點(diǎn)樣(微量注射器5uL、毛細(xì)管、移液槍5 uL)，重復(fù)3次，每次點(diǎn)樣完后用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干，每點(diǎn)擴(kuò)散直徑不超過(guò)5 mm。將點(diǎn)好樣的濾紙卷成筒狀，使用大頭針縫好(按課本操作步驟用針線縫，常常扯爛濾紙，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。

(3)展開(kāi)[9]。將盛有20 mL展開(kāi)劑的培養(yǎng)皿迅速置于500 mL的燒杯中，并將點(diǎn)樣筒直立于培養(yǎng)皿中(點(diǎn)樣端在下)，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時(shí)，取出濾紙，用鉛筆畫出溶劑前沿界線，吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干。

(4)顯色。用噴霧器均勻噴涂0.1%茚三酮溶液(展開(kāi)劑1、2、3所配茚三酮以正丁醇做溶劑，展開(kāi)劑4所配茚三酮以乙醇做溶劑)，立即用熱風(fēng)吹風(fēng)機(jī)吹干，即可出現(xiàn)不同位置和顏色的斑點(diǎn)。

(5)Rf值計(jì)算。

Rf=原點(diǎn)到色譜點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離

2.2 固定相的優(yōu)化[10,11]

(1)薄層板。取薄層板1張(22×14 cm)。

(2)點(diǎn)樣。按照2.1優(yōu)化的最佳點(diǎn)樣方式進(jìn)行點(diǎn)樣。

(3)展開(kāi)與顯色。在(500 mL)的燒杯中倒入1 cm的展開(kāi)層，用鑷子將點(diǎn)好樣的薄層板放入燒杯中，點(diǎn)樣端在下，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時(shí)，取出薄層板。其余步驟與2.1一致。

2.3 顯色方式的優(yōu)化[12,13]

(1)濾紙或薄層板準(zhǔn)備和點(diǎn)樣方式按照2.1和2.2優(yōu)化的步驟。

(2)展開(kāi)與顯色。展開(kāi)劑為100 mg茚三酮混合4種展開(kāi)劑，將點(diǎn)樣筒或板放入展開(kāi)劑中，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時(shí)，取出濾紙，用鉛筆標(biāo)記溶劑前沿，吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。即可出現(xiàn)不同位置和顏色的斑點(diǎn)，用鉛筆描出斑點(diǎn)輪廓。根據(jù)Rf值公式計(jì)算各樣品的Rf值。

3 結(jié)果與分析[14,15]

3.1 點(diǎn)樣方式優(yōu)化結(jié)果分析

用微量注射器、毛細(xì)管和移液槍分別點(diǎn)樣現(xiàn)象，以傳統(tǒng)方法進(jìn)行分離(固定相：濾紙；流動(dòng)相：V(正丁醇)：V(冰醋酸)=4∶1；顯色：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液)，微量注射器和毛細(xì)管易戳破濾紙而且點(diǎn)樣圈不均勻，不易操作，移液槍點(diǎn)樣5uL量易于控制且點(diǎn)樣圈大小一致，故采用移液槍進(jìn)行點(diǎn)樣操作。

3.2 固定相優(yōu)化及展開(kāi)劑優(yōu)化結(jié)果分析

以濾紙和薄層板固定相載體，以四種不同展開(kāi)劑為流動(dòng)相，對(duì)4種不同類型的氨基酸進(jìn)行分離，兩種固定相及四種不同展開(kāi)劑均能達(dá)到明顯分離效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

由表1可知，采用薄層板進(jìn)行層析分離效果優(yōu)于濾紙。Rf值表示溶質(zhì)在支持物上移動(dòng)的速率，影響Rf值因素很多，主要受物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性、支持物、層析所用溶劑、溫度、展開(kāi)方式、pH及樣品溶液中雜質(zhì)的影響[5]，在進(jìn)行氨基酸分離鑒定時(shí)薄層色譜層析法比紙色譜層析法更具有速度快、斑點(diǎn)集中和顯色靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

四種不同類型的展開(kāi)劑均能達(dá)到分離目的。結(jié)合分離效果、時(shí)間和試劑毒性，2號(hào)展開(kāi)劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)分離效果較好、分離時(shí)間較短且毒性較低； 4號(hào)展開(kāi)劑乙醇易揮發(fā)使展開(kāi)劑濃度不準(zhǔn)確，展開(kāi)時(shí)間較長(zhǎng)，而且展開(kāi)劑需要臨時(shí)配制導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作繁瑣，故不宜采用。

因此，以薄層板做固定相，以2號(hào)展開(kāi)劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)做流動(dòng)相，采用移液槍進(jìn)行點(diǎn)樣操作分離效果最佳。

3.3 顯色方式優(yōu)化結(jié)果分析

以薄層板做固定相，采用移液槍進(jìn)行點(diǎn)樣操作，展開(kāi)劑為100 mg茚三酮混合4種展開(kāi)劑，對(duì)4種不同類型的氨基酸進(jìn)行分離，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，采用100 mg茚三酮混合2號(hào)展開(kāi)劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)做流動(dòng)相，作為新展開(kāi)劑進(jìn)行分離，分離速度快，效果明顯，顯色靈敏，實(shí)驗(yàn)時(shí)間明顯縮短。綜上所述，將茚三酮加入用V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2的展開(kāi)劑中做流動(dòng)相，以薄層板做固定相，移液槍點(diǎn)樣，實(shí)驗(yàn)過(guò)程不需要接觸有毒試劑，實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯。達(dá)到預(yù)期目的。

表1 濾紙和薄層色譜層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

表2 薄層色譜層析優(yōu)化結(jié)果