朱 妤，劉金玲，王建華，王曉艾

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院 1中醫(yī)科， 2呼吸科， 浙江 杭州 310012)

哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的輔助性T淋巴細(xì)胞2(T helper cell 2, Th2)介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，微小RNA(microRNA，miRNA)參與了哮喘的發(fā)病環(huán)節(jié)[2-3]。miRNA是一種通過(guò)促進(jìn)mRNA降解或阻斷蛋白質(zhì)翻譯而起到基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑作用的短鏈非編碼RNA[4]，可通過(guò)抑制數(shù)百個(gè)靶mRNA來(lái)調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能。miRNA是免疫系統(tǒng)中基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，miRNA表達(dá)失調(diào)與炎癥性疾病密切相關(guān)[5-6]。miRNA-155在肺部各類疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用，并可通過(guò)調(diào)節(jié)靶向免疫系統(tǒng)中基因表達(dá)來(lái)參與如哮喘、肺癌、肺炎及肺纖維化等肺部疾病的發(fā)展形成[7-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155在哮喘小鼠肺組織中高表達(dá)，具有調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)的功能，是哮喘小鼠肺組織中表達(dá)最高的miRNA之一[9]。

免疫系統(tǒng)中的CD4+T細(xì)胞在過(guò)敏性炎癥中起中心作用[10]，但miRNA-155在CD4+T細(xì)胞中的生物學(xué)作用尚未得到充分研究。本研究旨在通過(guò)觀察哮喘小鼠CD4+T細(xì)胞中miRNA-155表達(dá)及被糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)調(diào)節(jié)的過(guò)程來(lái)探討糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘小鼠CD4+T細(xì)胞中miRNA-155表達(dá)調(diào)控的影響，以期對(duì)加深理解它們?cè)谥旅舭l(fā)病機(jī)制中的作用以及為尋找潛在的抗炎治療靶點(diǎn)提供新的證據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

60只雌性BALB/c小鼠(體重18～20 g； 4～6周齡)購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司[SCXK(京)2014-0001]。所有小鼠在室溫和恒濕(55%±5%)條件下，以12 h光/暗循環(huán)在EVC籠具中飼養(yǎng)。小鼠可隨意飲用水和食物。浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(浙)2018-0001]動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案。

2 方法

2.1哮喘模型的建立 采用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)激發(fā)致敏鼠, 按文獻(xiàn)報(bào)道[11]的方法建立哮喘模型。在第0天和第14天，用100 μg 的OVA(S7951，Sigma)和1 mg的氫氧化鋁(77161，Thermo)溶解在200 μL的生理鹽水中腹腔內(nèi)注射免疫刺激小鼠。然后于第22、23和24天，再次腹腔注射注入200 μg卵清蛋白。治療組治療時(shí)，每次激發(fā)前 1 h腹腔注射0.2 mg/kg地塞米松(Sigma)。對(duì)哮喘發(fā)病過(guò)程進(jìn)行觀察時(shí),在造模后0、3、7 d各取8只小鼠檢測(cè)。造模并使用地塞米松治療時(shí)，密切觀察動(dòng)物機(jī)體狀態(tài)，選取造模成功的存活小鼠進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)并確保每組最終至少5只造模成功的存活小鼠。

2.2肺組織病理學(xué)觀察 獲得支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)后，收集肺組織。肺組織用4%的多聚甲醛固定24 h，包埋在石蠟中。4 μm厚度切片，按照蘇木精和伊紅(HE)染色步驟進(jìn)行染色觀察。PAS(Sigma)染色中使用6 μm厚度切片以觀察量化杯狀細(xì)胞增生。 染色后在Nikon顯微鏡上獲取圖像。

2.3流式細(xì)胞術(shù)分選細(xì)胞 用5 mL紅細(xì)胞裂解緩沖液將小鼠脾臟組織切成小塊，4 ℃、1 500 r/min離心7 min，離心后丟棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞顆粒。用細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基(1×1010/L)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行再懸浮，保存于液氮罐中。使用MoFlo(Beckman)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色分類。將FACS管中的液體體積調(diào)節(jié)到50 μL，并加入熒光標(biāo)記的CD4和CD8抗體。細(xì)胞與Fc阻斷劑一起孵育5 min，然后用抗CD4(0.1 g)和CD8(0.2 g)抗體對(duì)1×106細(xì)胞進(jìn)行染色。CD8抗體標(biāo)記PerCP，CD4抗體標(biāo)記FITC(BD Biosciences)。將分選的細(xì)胞收集后進(jìn)行進(jìn)一步分析

2.4RT-qPCR分析 使用TRIzol(Invitrogen)從各組織細(xì)胞中提取總RNA。為了進(jìn)行qPCR分析，使用qScript microRNA cDNA合成試劑盒(Quanta BioSciences)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用CFX384實(shí)時(shí)系統(tǒng)定量PCR(qPCR)對(duì)miRNA進(jìn)行定量分析，并使用U6作為內(nèi)參照。所有使用的引物均由上海生工生物工程有限公司(miRNA-155，Q0000165-1-2；U6，MQP-0201)提供，miRNA-155的正向引物序列為5’-GCCTTAATGCTAATCGTGATAG-3’， 反向引物序列為3’-TTCCGTATGCATCATGTGAGTA-5’；U6的正向引物序列為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物序列為5’-AAGAAACGATACAGATTGGAGTA-3’。分別在42 ℃和70 ℃下進(jìn)行60 min熱循環(huán)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和變性，隨后進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增周期，包括95 ℃ 5 s(變性)和60 ℃ 30 s(延長(zhǎng))。采用2-ΔΔCt方法將miRNA-155進(jìn)行量化分析。

2.5免疫組化染色 對(duì)各組小鼠肺組織的石蠟切片進(jìn)行CD4的免疫組織化學(xué)染色。采用EnVision二步法進(jìn)行免疫組化染色并用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色法顯色，NIKON顯微鏡成像后使用IPP圖像分析軟件圖計(jì)數(shù)和尺寸工具用于計(jì)算CD4+T細(xì)胞密度，定量組織切片中陽(yáng)性免疫信號(hào)強(qiáng)度。

2.6ELISA實(shí)驗(yàn) 按照ELISA試劑盒(BD)說(shuō)明書(shū)中描述方法，測(cè)定BALF中白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)、IL-5、 IL-13和干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，方差分析后進(jìn)行單因素方差分析或非配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miRNA-155在哮喘小鼠中表達(dá)上調(diào)

哮喘小鼠肺組織切片病理學(xué)檢查，HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，哮喘小鼠氣道炎癥和黏液分泌增強(qiáng),見(jiàn)圖1A。哮喘小鼠肺組織中的miRNA-155檢測(cè)結(jié)果顯示哮喘組肺中miRNA-155顯著上調(diào)(P<0.01),見(jiàn)圖1B。RT-qPCR分析結(jié)果表明，與總外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)相比，miRNA-155在流式細(xì)胞術(shù)分選的CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)升高(P<0.01),見(jiàn)圖1C，并隨接觸過(guò)敏原時(shí)間的增加，miRNA-155水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)圖1D。相關(guān)性分析顯示，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)物疾病癥狀加重，CD4+T細(xì)胞中miRNA-155水平的表達(dá)升高與疾病進(jìn)程呈正相關(guān),見(jiàn)圖1E。

Figure 1.Up-regulated expression of miRNA-155 in lung tissues and CD4+T cells of the asthmatic mice. A: HE staining of the lung tissues after modeling; B: RT-qPCR was used to analyze the expression of miRNA-155 in the lung tissues; C: the expression of miRNA-155 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and CD4+T cells from the spleen of the asthmatic mice; D: the expression of miRNA-155 in the splenic CD4+T cells of the mice sensitized for 3 d or 7 d; E: the relationship between the expression of miRNA-155 in CD4+T cells of mouse spleen and disease progression. Mean±SD.n=6～8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPBMCs;△P<0.05,△△P<0.01vs0 d.

圖1miRNA-155在哮喘小鼠肺組織和CD4+T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)

2 糖皮質(zhì)激素治療改善哮喘小鼠肺炎癥反應(yīng)并降低miRNA-155的表達(dá)

HE和PAS染色顯示，與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠的肺組織炎性浸潤(rùn)顯著，給予糖皮質(zhì)激素治療后可明顯減輕支氣管周圍和血管周圍炎癥，減少增生杯狀細(xì)胞的黏液分泌,見(jiàn)圖2A、B。RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素治療后哮喘小鼠肺組織中的miRNA-155水平顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖2C。對(duì)分選的脾臟CD4+T細(xì)胞中的miRNA-155表達(dá)情況檢測(cè)結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素治療后CD4+T細(xì)胞中的miRNA-155顯著下調(diào)(P<0.01),見(jiàn)圖2D。

Figure 2.Glucocorticoid (GC) therapy reduced pulmonary inflammatory responses and the expression of miRNA-155 in the asthmatic mice. A: HE staining of the lung tissues after GC treatment; B: PAS staining of the lung tissues after GC treatment; C: the expression of miRNA-155 in the lung tissues after GC treatment; D: the expression of miRNA-155 in CD4+T cells of mouse spleen after GC treatment. Mean±SD.n=6～8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma group.

圖2糖皮質(zhì)激素治療改善哮喘小鼠肺炎癥反應(yīng)并降低miRNA-155表達(dá)

3 糖皮質(zhì)激素治療抑制脾臟中CD4+ T細(xì)胞的水平

通過(guò)流式細(xì)胞分選對(duì)脾臟中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可抑制哮喘組小鼠脾臟中的CD4+CD8-細(xì)胞比例增加(P<0.01)，改善了Th1/Th2失衡，見(jiàn)圖3。

4 糖皮質(zhì)激素治療抑制肺組織中CD4+ T細(xì)胞的聚集

CD4免疫組化染色結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素治療可改善哮喘造模引起的肺組織中CD4+T細(xì)胞的聚集(P<0.01)，改善肺組織中免疫炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),見(jiàn)圖4。

5 糖皮質(zhì)激素治療改變BALF中細(xì)胞因子的水平

哮喘組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平升高，用糖皮質(zhì)激素治療后，BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平下降(P<0.01)。相比于對(duì)照組，哮喘組BALF的IFN-γ水平未改變，糖皮質(zhì)激素治療后，IFN-γ水平顯著增加(P<0.01),見(jiàn)圖5。

討 論

過(guò)敏性疾病如哮喘和過(guò)敏性鼻炎，是造成重大衛(wèi)生保健負(fù)擔(dān)的常見(jiàn)疾病[12]。哮喘是一種以低氣道炎癥為特征的綜合癥，它影響著全世界大約3億人[13]，這些疾病的特點(diǎn)是發(fā)病率高、費(fèi)用高、生活質(zhì)量差，估計(jì)每年治療費(fèi)用超過(guò)560億美元[14]。哮喘發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，關(guān)于哮喘炎癥途徑的調(diào)節(jié)是未來(lái)醫(yī)療防治的重點(diǎn)方向。治療哮喘的一線藥物是糖皮質(zhì)激素[15]，它可控制哮喘的發(fā)作、緩解氣道炎癥反應(yīng)[16]，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究希望闡明糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘小鼠CD4+T細(xì)胞中miRNA-155表達(dá)調(diào)控的影響。

Figure 3.Glucocorticoid (GC) therapy inhibited the levels of CD4+T cells in the spleen. Mean±SD.n=6～7.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsasthma group.

圖3糖皮質(zhì)激素治療抑制脾臟中CD4+T細(xì)胞的生成

Figure 4.Glucocorticoid (GC) therapy inhibited CD4+T cell accumulation in the lung tissues. Mean±SD.n=5～7.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsasthma group.

圖4糖皮質(zhì)激素治療抑制肺組織中CD4+T細(xì)胞的聚集

在免疫系統(tǒng)中miRNAs可調(diào)節(jié)編碼各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的mRNA表達(dá)[17]，提示它們可能具有作為炎癥和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子的功能。miRNA已成為用于診斷和治療許多過(guò)敏炎癥疾病免疫監(jiān)測(cè)中的分子標(biāo)志物[18]。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155的表達(dá)與哮喘有關(guān)[19]。miRNA-155來(lái)源于原癌基因B細(xì)胞整合簇的非編碼轉(zhuǎn)錄本[20]，對(duì)于正常B細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生是必不可少的。我們的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155在哮喘小鼠肺組織及脾臟CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)升高，并且隨著接觸過(guò)敏原時(shí)間的增加水平顯著升高，提示哮喘發(fā)病過(guò)程中CD4+T細(xì)胞內(nèi)存在miRNA-155的內(nèi)在調(diào)節(jié)作用。對(duì)哮喘組小鼠進(jìn)行了糖皮質(zhì)激素的治療后，可明顯減輕支氣管周圍和血管周圍炎癥，減少增生杯狀細(xì)胞的黏液分泌。糖皮質(zhì)激素治療后哮喘小鼠肺組織和脾臟CD4+T細(xì)胞中的miRNA-155表達(dá)量顯著降低,提示miRNA-155可能是糖皮質(zhì)激素治療作用中的一個(gè)靶點(diǎn)，有希望鑒定為哮喘患者血漿中的一種可能的生物標(biāo)志物。

我們發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素治療后，脾臟中CD4+/CD8-細(xì)胞比例降低，肺組織中CD4+T細(xì)胞的聚集減少且肺泡中IL-4、IL-5和IL-13水平下降。CD4+T細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13在變應(yīng)性炎癥的病理生理過(guò)程中起重要作用[21]。IL-4和IL-5促進(jìn)Th2細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和IgE產(chǎn)生[22]，而IL-13是介導(dǎo)哮喘黏蛋白產(chǎn)生和氣道高反應(yīng)性的有效細(xì)胞因子[23]。糖皮質(zhì)激素可能通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA-155 的表達(dá)從而影響CD4+T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)功能，最終起到細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)作用從而減緩炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

Figure 5.Glucocorticoid (GC) therapy altered the levels of cytokines in the bronchoalveolar lavage fluid. Mean±SD.n=5～7.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma group.

圖5糖皮質(zhì)激素治療改變支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞因子的水平

總之，miRNA-155在OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠的肺組織和脾中CD4+T細(xì)胞表達(dá)升高，而糖皮質(zhì)激素可抑制過(guò)敏性哮喘小鼠的肺組織和脾中CD4+T細(xì)胞miRNA-155表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)提示了miRNA-155可能是糖皮質(zhì)激素治療過(guò)敏性哮喘疾病的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。