王 霞，王少賢△，方朝義，王杰鵬，曠湘楠，趙 丹，王一旭

(1河北中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)診斷教研室， 2河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 石家莊 050200)

伴隨著社會(huì)競爭日益激烈和生活節(jié)奏不斷加快，緊張的工作環(huán)境、復(fù)雜的人際關(guān)系和沉重的經(jīng)濟(jì)壓力等長期、慢性心理應(yīng)激已成為威脅人類健康的重要因素。機(jī)體體重增長緩慢和飲食量下降，則是常見的慢性應(yīng)激反應(yīng)。本研究動(dòng)態(tài)觀察了慢性束縛應(yīng)激大鼠攝食量及體重變化，并采用ELISA、Western blot和RT-qPCR方法分別測定其血清瘦素(leptin)水平及下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，ARC)中食欲調(diào)控因子瘦素受體(leptin receptor，LEPR)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白(agouti-related protein，AgRP)、阿黑皮素原(proopiomelanocortin，POMC)和可卡因苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物(cocaine amphetamine-regulated transcript，CART)的表達(dá)情況，以探討應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體出現(xiàn)攝食和能量代謝異常的中樞機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

雄性SD大鼠，體重180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，光照明暗各12 h(明7：00～19：00，暗19：00～7：00),恒溫、恒濕[室溫(21±1)℃，相對濕度40%～60%]，自由攝食，飲水。

2 試劑與儀器

2.1主要試劑 Leptin和LEPR ELISA試劑盒購自Phoenix Pharmaceuticals；RIPA裂解液購自Pierce Biotechnology；兔抗AgRP抗體購自Santa Cruz Biotechnology；兔抗 LEPR抗體購自Invitrogen；兔抗POMC抗體購自Signalway Antibody；兔抗NPY和兔抗CART抗體購自Cell Signaling Technology; 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司；TRIzol購自Invitrogen；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒購自Fementas。

2.2主要儀器 T10型手持電動(dòng)勻漿器購自IKA； SpectraMax? Plus 384讀板機(jī)(酶標(biāo)儀)購自MD； ND2000型微量分光光度計(jì)購自Thermo； ABI 7300 型熒光定量PCR System購自ABI； DYY-Ⅲ型電泳儀、DYY-Ⅲ40B型轉(zhuǎn)膜槽和DYCZ-24D型垂直電泳槽購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自UVP；3K15低溫離心機(jī)購自Sigma。

3 方法

3.1動(dòng)物分組及模型制備 90只實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對照(blank control，BC)組、7 d應(yīng)激(7-d stress，7-S)組和21 d應(yīng)激(21-d stress，21-S)組，每組30只。應(yīng)激方法同參考文獻(xiàn)[1]，將大鼠束縛于特制的T型束縛架上，每日3 h，束縛時(shí)點(diǎn)隨機(jī)。7-S組和21-S組分別持續(xù)束縛應(yīng)激7 d和21 d;BC組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)21 d，不予束縛應(yīng)激干預(yù)。

3.2攝食量和體重檢測 稱量大鼠應(yīng)激前1 d(day 0)的體重和攝食量及應(yīng)激后連續(xù)21 d(day 1～day 21)的體重和攝食量。攝食量計(jì)算以前 1 d給食量減去當(dāng)天剩余食量。

3.3檢測標(biāo)本制備 7-S組于實(shí)驗(yàn)第8天、BC組和21-S組于實(shí)驗(yàn)第22天，以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，斷頭取血2 mL分離血清備用；冰盤上快速取腦，液氮速凍，摳取ARC組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4ELISA法測定大鼠血清leptin及下丘腦ARC LEPR的含量 根據(jù)ELISA試劑盒操作說明，于酶標(biāo)儀上檢測血清leptin含量。另取腦組織ARC置1 mL NaCl溶液中煮沸3 min，加0.5 mL 1 mol/L冰醋酸，手持電動(dòng)勻漿器勻漿，以0.5 mL 1 mol/L NaOH中和混勻，離心，取上清，根據(jù)試劑盒說明檢測ARC組織中LEPR蛋白含量。

3.5Western blot法測定下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART 的蛋白表達(dá) ARC組織置EP管，加RIPA緩沖液 1 mL進(jìn)行勻漿，冰浴反應(yīng)，充分裂解，離心，取上清，提取總蛋白，采用分光光度計(jì)測定蛋白含量。每個(gè)蛋白樣本取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜。用蒸餾水振蕩洗膜3次，每次5 min,然后以5%脫脂奶粉，脫色搖床搖動(dòng)封閉1 h；TBST振蕩洗膜3次，每次5 min，加兔源性 I 抗(β-actin、LEPR、NPY、POMC和CART抗體的稀釋度均為1∶300，AgRP抗體的稀釋度為1∶200)，4 ℃孵育過夜；TBST振蕩洗膜3次，每次5 min，加入1∶3 000的 II 抗(山羊抗兔IgG-HRP)，4 ℃孵育1 h；TBST室溫洗膜3次，每次10 min，然后用TBS 洗膜5 min，化學(xué)發(fā)光法獲得目標(biāo)條帶。Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶積分吸光度(IA)，β-actin為內(nèi)參照，分別計(jì)算LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART蛋白表達(dá)相對含量。

3.6RT-qPCR法測定下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC、CART 的mRNA表達(dá) 每樣本50 μg，TRIzol法提取ARC組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測定A260與A280，結(jié)果28S和18S條帶清晰可見，5S條帶較弱彌散，表明所提取總RNA降解較少，完整性良好；A260/A280比值在1.8～2.0之間，純度較高，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

根據(jù)M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，20 μL反應(yīng)體系(總RNA 1 μg)于PCR儀上42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)試劑盒說明操作，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增：95 ℃ 5 min; DNA變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，引物延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)引物延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。以β-actin 作為內(nèi)參照，空白對照組第1號(hào)樣品設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)1，SDSV1.3軟件分析獲得各樣本目的基因Ct值，ΔΔCt=(Ct實(shí)驗(yàn)組-Ctβ-actin)-(Ct對照組-Ctβ-actin)，根據(jù)公式RQ=2-ΔΔCt計(jì)算各樣本LEPR、AgRP、NPY、POMC和CART mRNA表達(dá)量，用于統(tǒng)計(jì)分析。

LEPR的上游引物序列為5’-GCCAAAGTCAACTACGCTCTT-3’， 下游引物序列為5’-CTTCCATACGCAAACCCA-3’；NPY的上游引物序列為5’-CGTGTGTTTGGGCATTCT-3’， 下游引物序列為5’-CAGTGTCTCAGGGCTGGAT-3’；AgRP的上游引物序列為5’-CTGCCGCTTCTTCAATACC-3’， 下游引物序列為5’-CTTTGCCCAACATCCGTT-3’；POMC的上游引物序列為5’-TGCTTCAGACCTCCATAGACG-3’， 下游引物序列為5’-AGGGCTGTTCATCTCCGTT-3’；CART的上游引物序列為5’-GACATCTACTCTGCCGTGGA-3’， 下游引物序列為5’-CGGAAT GCGTTTACTCTTGA-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GGTCATCACCATTGGCAA-3’， 下游引物序列為5’-GAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3’。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用一般線性模型的重復(fù)測量過程對體重和攝食量數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量方差分析，并用多因素方差分析LSD法進(jìn)行相同時(shí)點(diǎn)上的兩組間比較；其它數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，多組間比較采用SNK-q法。21-S組大鼠體重/攝食量和下丘腦弓狀核食欲因子表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢性束縛應(yīng)激對大鼠體重和攝食量的影響

從表1可以看出，束縛應(yīng)激前，BC組和21-S組大鼠體重和攝食量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。從束縛應(yīng)激第2天開始，在相同時(shí)點(diǎn)內(nèi)21-S組大鼠的體重明顯低于BC組(P<0.05或P<0.01)；從束縛第1天開始，在相同時(shí)點(diǎn)內(nèi)21-S組大鼠攝食量始終低于BC組，尤其在應(yīng)激第1、7、8、10、11及13～21天，2組間的差異最為明顯(P<0.05或P<0.01)，見表1。

2 慢性束縛應(yīng)激對大鼠血清leptin及下丘腦ARC中LEPR含量的影響

大鼠血清中l(wèi)eptin含量7-S組和21-S組較BC組均明顯增加(P<0.05)；7-S組和21-S組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表2。

大鼠下丘腦ARC中LEPR含量7-S組和21-S組較BC組均有所增加，尤其21-S組增加更為明顯(P<0.05)，見表2。

3 慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC中 LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART蛋白表達(dá)的影響

與BC組比較，7-S組和21-S組大鼠下丘腦的ARC中NPY和AgRP蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，LEPR、POMC和CART的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；21-S組較7-S組ARC中NPY和AgRP的蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)，而LEPR和POMC表達(dá)則有所增高(P<0.05)，7-S組和21-S組大鼠下丘腦ARC中CART蛋白表達(dá)雖然也有所變化，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1、表3。

表1 慢性束縛應(yīng)激對大鼠體重和攝食量的影響

*P<0.05,**P<0.01vsBC group at the same time point.

表2慢性束縛應(yīng)激對大鼠血清leptin和ARC中LEPR含量的影響

Table 2.The effects of chronic immobilization stress on serum leptin and LEPR in ARC of rats (Mean±SD.n=10)

GroupLeptin (μg/L)LEPR (μg/L)BC3.58±1.317.53±2.957-S 6.40±1.81?9.10±1.46?21-S6.71±1.42?11.69±2.14?#

*P<0.05vsBC group；#P<0.05vs7-S group.

4 慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC 中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART mRNA表達(dá)的影響

7-S組和21-S組大鼠下丘腦ARC中NPY和AgRP的mRNA表達(dá)較BC組均顯著減少(P<0.05)，而LEPR和POMC的mRNA表達(dá)則不同程度增加(P<0.05)；21-S組與7-S組比較，大鼠下丘腦ARC中NPY和AgRP的mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，而LEPR和POMC 的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。3組比較，大鼠下丘腦ARC中CART的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表4。

Figure 1.The images of Western blot showed the effects of chronic immobilization stress on the protein expression of LEPR, NPY, AgRP, POMC and CART in ARC of the rats.

圖1Westernblot檢測慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART蛋白表達(dá)的影響

表3慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART蛋白表達(dá)的影響

Table 3.The effects of chronic immobilization stress on the protein expression of LEPR, NPY, AgRP, POMC and CART in ARC of rats (Mean±SD.n=3)

IndexBC7-S21-SLEPR0.22±0.010.45±0.05?0.60±0.07?#NPY0.97±0.020.76±0.03?0.27±0.01?#AgRP1.81±0.031.09±0.03?0.58±0.03?#POMC1.40±0.071.62±0.04?1.78±0.11?#CART1.63±0.081.98±0.02?2.05±0.08?

*P<0.05vsBC group；#P<0.05vs7-S group.

5 21-S組大鼠體重/攝食量與下丘腦ARC 中食欲因子表達(dá)的相關(guān)性

21-S組大鼠體重與其ARC中LEPR和CART的mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，與

表4慢性束縛應(yīng)激對大鼠下丘腦ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CARTmRNA表達(dá)的影響

Table 4.The effects of chronic immobilization stress on the mRNA expression of LEPR, NPY, AgRP, POMC and CART in ARC of rats (Mean±SD.n=6)

IndexBC7-S21-SLEPR1.01±0.212.57±0.57?3.82±0.73?#NPY0.90±0.070.41±0.05?0.31±0.03?#AgRP0.97±0.090.80±0.08?0.42±0.09?#POMC0.43±0.070.54±0.08?0.86±0.08?#CART0.34±0.060.38±0.070.42±0.07

*P<0.05vsBC group;#P<0.05vs7-S group.

NPY的mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；攝食量與POMC的mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。體重與攝食量無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表5。

表5 21-S組大鼠體重、攝食量及下丘腦弓狀核食欲因子mRNA表達(dá)的相關(guān)性

*P<0.05,**P<0.01.

討 論

應(yīng)激是機(jī)體整個(gè)適應(yīng)、保護(hù)機(jī)制的一個(gè)重要組成部分。適度應(yīng)激有利于機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境中保持自身穩(wěn)態(tài)，而過強(qiáng)或持久、頻繁的應(yīng)激則可能誘發(fā)多種慢性疾病[2-4]。目前，束縛應(yīng)激是研究動(dòng)物心理應(yīng)激反應(yīng)最常用的模型之一[5]。束縛制動(dòng)使動(dòng)物軀體活動(dòng)受限，并由此產(chǎn)生掙扎、憤怒、焦慮、無助和抑郁等一系列情緒變化及皮毛無光，耳廓淡白，食欲下降和體重減輕等軀體癥狀，這既很好地模擬了機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下心理和生理的變化，又避免了造模本身對軀體的直接病理損傷[6-7]。本研究結(jié)果證實(shí)，束縛應(yīng)激大鼠攝食量和體重較同期空白對照組大鼠明顯下降，且應(yīng)激時(shí)間越長，對體重增長影響越大，與前期研究結(jié)果一致[8]，說明慢性束縛應(yīng)激是影響機(jī)體能量儲(chǔ)備的不利因素之一。

目前普遍認(rèn)為，下丘腦是機(jī)體中樞維持能量平衡的核心，包含多個(gè)與食欲調(diào)控有關(guān)的神經(jīng)核團(tuán)，其中緊鄰第三腦室的ARC作為一個(gè)食欲調(diào)節(jié)和能量平衡的綜合體已成為廣大研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)[9-10]。ARC包含2組與攝食相關(guān)但作用相反的一級(jí)神經(jīng)元NPY/AgRP和POMC/CART[11]，這些神經(jīng)元接收外周傳入的營養(yǎng)信息后，協(xié)同調(diào)控NPY、AgRP、POMC和CART等食欲因子的合成和分泌，并通過神經(jīng)纖維投射實(shí)現(xiàn)不同神經(jīng)核團(tuán)之間的信號(hào)傳遞，最終維持下丘腦“食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)”的平衡。

瘦素是一種能感知自身能量狀態(tài)的蛋白質(zhì)類激素。作為食欲調(diào)節(jié)鏈上關(guān)鍵的一環(huán)，瘦素由白色脂肪細(xì)胞分泌后，通過外周和中樞(主導(dǎo)作用)2條途徑參與機(jī)體能量代謝的調(diào)控。下丘腦ARC是瘦素中樞作用的關(guān)鍵部位。作為主要參與介導(dǎo)瘦素調(diào)節(jié)體重作用的功能性受體LEPR，在弓狀核促食欲NPY/AgRP神經(jīng)元及抑食欲POMC/CART神經(jīng)元均顯著表達(dá)[12-13]。經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入下丘腦的瘦素，通過與LEPR特異性結(jié)合，將飽食信號(hào)傳遞給該處的瘦素反應(yīng)性食欲調(diào)控神經(jīng)元，激活食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)，從而全面啟動(dòng)攝食及能量平衡的瘦素調(diào)控通路。

下丘腦ARC的各種食欲因子是瘦素循環(huán)作用的直接靶點(diǎn)[14]。以往研究表明，NPY通過與ARC內(nèi)廣泛分布的NPY受體特異性結(jié)合，激發(fā)機(jī)體的攝食效應(yīng)[15-16]。AgRP是一種較NPY更為強(qiáng)效和長效的食欲刺激素。表達(dá)于ARC的POMC在前轉(zhuǎn)變素酶1的作用下釋放其剪切產(chǎn)物α-促黑素細(xì)胞激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)和促腎上腺皮質(zhì)激素，前者通過激活與機(jī)體新陳代謝密切相關(guān)的黑皮質(zhì)素受體3/4(MC3-R/MC4-R)，使機(jī)體產(chǎn)生飽腹感，并向其它腦區(qū)傳達(dá)飽食的信號(hào)，以減少攝食行為[17]。同時(shí)對MC3-R和MC4-R高度敏感的AgRP可通過與之競爭性結(jié)合，從而抑制黑皮素受體信號(hào)，拮抗α-MSH 的抑制攝食作用[18]。CART廣泛存在于與攝食及體重密切相關(guān)的腦區(qū)，與瘦素具有相互調(diào)節(jié)作用[19-20]，其強(qiáng)大的抑食功能已在嚙齒類動(dòng)物和部分水生動(dòng)物研究中被初步驗(yàn)證[21-23]。

本研究結(jié)果表明，應(yīng)激因素對大鼠攝食行為及體重增長具有消極影響，并能顯著提高其血清瘦素水平，下調(diào)ARC中促食欲因子NPY和AgRP表達(dá)，上調(diào)抑食欲因子POMC和CART表達(dá)。進(jìn)一步的Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示以NPY/AgRP和POMC/CART為代表的2類食欲因子表達(dá)失衡可能是慢性束縛應(yīng)激大鼠出現(xiàn)攝食減少、體重增長緩慢的關(guān)鍵中樞神經(jīng)內(nèi)分泌基礎(chǔ)之一，但具體作用機(jī)制及通路的研究有待進(jìn)一步開展。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激大鼠體重與攝食量之間并無顯著相關(guān)性，提示攝食量減少并非其體重增長延緩的唯一原因，很可能還與機(jī)體代謝水平有關(guān)，這已在本課題組基于代謝組學(xué)的相關(guān)研究中得到初步證實(shí)[24]，并將成為我們下一步深入研究的關(guān)注點(diǎn)之一。