李志遠(yuǎn)，左文松，代明晶

（1.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650106； 2.云南省文山壯族苗族自治州丘北縣人民醫(yī)院，云南 文山 663000）

復(fù)方制劑鉍鎂碳酸氫鈉片[1]組方中，甘草流浸膏占比為每1 000片160 g，而現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅收載該成分的鑒別項(xiàng)作為質(zhì)量控制指標(biāo)，僅能判斷處方中是否含有甘草流浸膏，無法判斷廠家在該藥品生產(chǎn)過程中是否嚴(yán)格按處方量投料生產(chǎn)；現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不能很好地區(qū)分不同廠家生產(chǎn)的藥品的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗(yàn)中選擇處方中甘草浸膏的有效成分甘草酸為指標(biāo)成分[2-5]，建立測(cè)定其含量的高效液相色譜（HPLC）法[6]，為該藥的質(zhì)量控制提供定量評(píng)價(jià)方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀，包括DGU-20A型脫氣機(jī)、LC-20AT型溶劑輸送泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A型柱溫箱、SPD-20A型紫外-可見檢測(cè)器，LCSolution化學(xué)工作站（日本島津公司）；FUNGILAB型超聲儀（FUNGILAB儀器公司，功率為180 W，頻率為 50/60 kHz）；CPA224S/CPA225D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

鉍鎂碳酸氫鈉片（昆明積大制藥有限公司，批號(hào)分別為130301，130305）；甘草酸銨對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110731）；乙腈（賽默飛世爾科技有限公司）、甲醇（默克公司）為色譜純，水為純化水，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表（%）

2.2 溶液制備

取甘草酸銨對(duì)照品10.00 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。取樣品適量，研細(xì)，稱取0.3 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲提取10 min，冷卻，加50%甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按鉍鎂碳酸氫鈉片的處方和工藝制備不含甘草的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）?？梢姡郎y(cè)峰與其他峰分離良好，陰性對(duì)照品溶液無干擾，理論板數(shù)按甘草酸峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用 50%甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積，記錄色譜圖，并以甘草酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=10 498X+4 625.6，R2=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，甘草酸質(zhì)量濃度在20.06～200.60 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一供試品溶液20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD=0.45%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為130305）適量，依法制備供試品溶液，精密量取20 μL，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD為2.00%（n=7），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為130305）適量，每份0.15 g，共6份，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲提取10 min，分別精密加入對(duì)照品溶液，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 甘草酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)130301）適量，共6份，同法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.56%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

耐用性試驗(yàn)：取供試品溶液，其他色譜條件不變，改變流速、改變柱溫、改變色譜柱品牌、相同品牌不同長(zhǎng)度，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖峰面積。結(jié)果的RSD為1.09%（n=5），表明方法耐用性好。

2.4 樣品含量測(cè)定

取2批樣品各適量，研細(xì)，稱取0.15 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲提取10 min，冷卻，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算樣品中甘草酸含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=7）

3 討論

3.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

提取溶劑確定：取樣品0.3 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，分別以30%，50%，70%，100%的甲醇溶液作為提取溶劑，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，以50%甲醇溶液作為提取溶劑效果較好。

提取容積確定：稱取樣品0.3 g，精密稱定，分別置25，50，100 mL容量瓶中，以50%甲醇作為提取溶劑，制成不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量分別為 5，10，20 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，提取容積為50 mL時(shí)效果較好，故選擇此法作為樣品的提取方法，并超聲10 min。

3.2 色譜條件選擇

參考2010年版《中國(guó)藥典（一部）》甘草含量的測(cè)定方法，對(duì)該流動(dòng)相體系、檢測(cè)波長(zhǎng)和供試品溶液的制備方法進(jìn)行了考察[4]，結(jié)果顯示，乙腈-0.05%磷酸溶液流動(dòng)相體系梯度洗脫所得到色譜圖基線較平穩(wěn)，且分離效果好；甘草酸在237 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

3.3 供試品溶液處理方法選擇

首先，分別采用30%，50%，70%，100%甲醇溶液進(jìn)行提取試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50%甲醇提取最完全，故以其作為提取溶劑[5]；其次，以不同提取容積對(duì)樣品進(jìn)行提取試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以50 mL為提取容積進(jìn)行提取效果最好。同時(shí)選用超聲提取方法（50 kHz，180 W，超聲時(shí)間為10 min）作為供試品溶液的處理方法。

3.4 溶液濃度與對(duì)照品選擇

本試驗(yàn)中需要配制對(duì)照品貯備液，原因在于其濃度較高，且不易改變，而稀釋易受環(huán)境影響，濃度易變，同時(shí)做加樣回收試驗(yàn)時(shí)每份樣品中需加入等量對(duì)照品。因此，采用等體積取同一濃度的對(duì)照品貯備液的方法可減小其誤差[7-8]。本試驗(yàn)中選擇甘草酸銨為對(duì)照品，在方法學(xué)數(shù)據(jù)采集時(shí)均已換算成甘草酸。

綜上所述，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于鉍鎂碳酸氫鈉片中甘草酸的含量測(cè)定。