楊運(yùn)南， 楊昌福， 劉亞楠， 羅 璠， 字向東， 高彥華

（青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

現(xiàn)代畜牧業(yè)正面臨過(guò)度依賴抗生素使用而導(dǎo)致的抗生素殘留、細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)和環(huán)境承載力降低等難題（陳振等，2017），益生菌作為飼用抗生素替代物擁有安全、環(huán)保等特點(diǎn)。益生菌飼喂動(dòng)物后，能夠改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)腸道免疫和改善微生物菌群（譙仕彥等，2014；王永等，2013）。因此，益生菌的分離及其功能的研究一直是飼用抗生素替代物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

屎腸球菌是一種產(chǎn)乳酸菌（LAB），其在動(dòng)物體內(nèi)有調(diào)節(jié)腸道菌群、腸道形態(tài)與黏液層以及腸上皮細(xì)胞免疫功能（譙仕彥等，2014）。王永等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌可以顯著促進(jìn)盲、結(jié)腸中乳酸桿菌的增殖，并且可顯著抑制仔豬結(jié)腸中大腸桿菌的增殖。方偉等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，添加不同劑量的屎腸球菌對(duì)仔豬腸絨毛高度、隱窩深度以及絨毛隱窩比存在不同程度的影響。李雨宸（2015）研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌定植腸道后可以增強(qiáng)小鼠上皮細(xì)胞抗菌肽Reg3γ的分泌，劉丹等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能明顯降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)直腸黏膜TNF-α的表達(dá)。丁爽等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌B13可提高斷奶仔豬免疫力和日增重，說(shuō)明腸球菌作為一種乳酸菌，具有促進(jìn)動(dòng)物腸道免疫，改善腸道健康的效果。

本課題組前期在牦牛腸道黏膜中分離出一株高產(chǎn)乳酸菌素腸球菌G2，乳酸菌素效價(jià)能為17.47×105IU/mL，并且具有廣泛抑菌活性，對(duì)酸具有較強(qiáng)的耐受性（張艷，2013）。目前關(guān)于牦牛腸黏膜源益生菌對(duì)健康動(dòng)物腸道菌群、形態(tài)和免疫功能的影響研究較少。因此，本研究將以小鼠為研究對(duì)象，探討屎腸球菌G2對(duì)健康小鼠腸道微生物、形態(tài)與腸道免疫功能的影響，為進(jìn)一步將屎腸球菌G2開(kāi)發(fā)成為益生菌制劑，替代飼用抗生素使用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 屎腸球菌G2由西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供，本實(shí)驗(yàn)室保藏。取保種菌液10μL平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng)后，挑取單菌落于37℃，200 r/min條件下培養(yǎng)，重復(fù)2～3次，至恢復(fù)活力。再挑取單菌落于3 mL M17培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)16～18 h，混勻后得109cfu/mL的屎腸球菌G2菌液。菌液經(jīng)由80℃水浴60 min滅活，12000 r/min離心2 min去上清，重懸于M17培養(yǎng)基中即得熱滅活菌液。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理 7周齡雌性C57BL/6小鼠[體重（18.1±0.470）g，SPF級(jí)]24只，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠飼養(yǎng)于恒溫、恒濕、清潔、無(wú)特殊病原體，室溫18～22℃，濕度45%～65%環(huán)境中，標(biāo)準(zhǔn)小鼠繁殖料購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，試驗(yàn)期間所有小鼠自由攝入無(wú)菌飲用水及飼料，定期更換墊料。隨機(jī)分為3個(gè)處理組，每組8只，分別為對(duì)照組（CON組）、熱滅活菌組（EHK組）與活菌組（ENT組）。CON組、EHK組和ENT組小鼠分別按照0.1 mL/只劑量灌胃M17肉湯、109cfu/mL熱滅活菌液、109cfu/mL屎腸球菌G2菌液。試驗(yàn)期共計(jì)14 d，前7 d為適應(yīng)期，后7 d為正式試驗(yàn)期。正式試驗(yàn)期第1、2、4、6天對(duì)小鼠按分組進(jìn)行灌胃處理，每只小鼠每日9:00灌胃1次，第1、3、5、7天無(wú)菌收集小鼠糞便，對(duì)糞便乳酸菌總數(shù)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。第8天，對(duì)小鼠進(jìn)行屠宰，收集肝臟、脾臟樣品，計(jì)算器官指數(shù)。收集結(jié)腸末端組織樣品、小鼠結(jié)腸內(nèi)容物，液氮速凍，-80℃保存。收集結(jié)腸末端樣品，10%中性甲醛固定，用于制作石蠟切片。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 腸道微生物數(shù)量 試驗(yàn)期間收集小鼠糞便，按照GB 4789.2-2010方法對(duì)小鼠糞便中產(chǎn)乳酸菌總數(shù)進(jìn)行菌落平板計(jì)數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束后，無(wú)菌收集小鼠結(jié)腸內(nèi)容物，用糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP328）提取結(jié)腸內(nèi)容物DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定腸球菌、乳桿菌和大腸桿菌的數(shù)量（高彥華，2014）。引物序列見(jiàn)表1，絕對(duì)定量反應(yīng)體系包括：2×SG fast mix 5.0μL，上游引物0.2μL（10μmol），下游引物0.2μL（10μmol）,模板1μL，加PCR-Grade Water至10μL。定量反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃3 s；退火30 s；40個(gè)循環(huán)。將Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到各細(xì)菌基因拷貝數(shù)。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立包含：質(zhì)粒重組、重組質(zhì)粒濃度檢測(cè)、質(zhì)粒拷貝數(shù)確定、質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值之間建立線性關(guān)系。絕對(duì)定量PCR的檢出限為：乳球菌104～1010拷貝，乳桿菌104～1010拷貝，大腸桿菌102～109拷貝。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

1.3.2 腸道形態(tài) 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，斷頸法處死小鼠并稱重。無(wú)菌采集小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸腸段，10%中性甲醛處理過(guò)夜，制作蘇木精-伊紅（H&E）染色石蠟切片。按照M.Wlodarska（2011）的方法對(duì)切片進(jìn)行腸道病理學(xué)評(píng)分，包括對(duì)腸腔壞死上皮存在的情況、表面上皮的增生及上皮細(xì)胞剝離情況、黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量及隱窩增生情況和黏膜下層水腫情況進(jìn)行評(píng)定。

1.3.3 腸道免疫因子 腸道抗菌肽胰島再生源蛋白（Reg3γ，Reg3β）、細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、黏蛋白（MUC2）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。TRizol法提取小鼠結(jié)腸組織RNA，1%瓊脂糖變性凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）方法反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反應(yīng)體系同1.3.1，采用GAPDH作為內(nèi)參基因，目的基因及內(nèi)參基因引物序列見(jiàn)表2。采用2^（-△△Ct）方法計(jì)算得到基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 器官指數(shù) 按以下公式計(jì)算器官指數(shù)與臟器指數(shù)：

表2 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

器官指數(shù)=（肝臟重+脾臟重）/體重×100；

臟器指數(shù)=臟器重/體重×100。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 18.0中One-Way ANOVA對(duì)各組之間的差異進(jìn)行單因素方差分析，采用T檢驗(yàn)對(duì)兩組之間的差異進(jìn)行分析，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 屎腸球菌G2對(duì)腸道微生物的影響 試驗(yàn)期間小鼠糞便中乳酸菌總菌平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示（圖1），在試驗(yàn)的第3、5天，ENT組乳酸菌總菌數(shù)量顯著高于CON組與EHK組（P＜0.05），CON組與EHK組菌落數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

同時(shí)對(duì)結(jié)腸內(nèi)容物中腸球菌、乳桿菌和大腸桿菌的數(shù)量進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各組之間腸球菌、乳桿菌和大腸桿菌的數(shù)量（圖2）差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 屎腸球菌G2對(duì)小鼠結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌數(shù)量的影響

2.2 屎腸球菌G2對(duì)小鼠結(jié)腸形態(tài)的影響 對(duì)屎腸球菌G2各處理組小鼠結(jié)腸形態(tài)的H&E染色切片進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖3，腸道病理學(xué)評(píng)分總分各處理組之間差異不顯著。ENT組杯狀細(xì)胞數(shù)量大于CON組與EHK組，但差異并不顯著（P＞0.05）。CON組隱窩深度顯著小于ENT組（P＜0.05），說(shuō)明屎腸球菌G2可以顯著影響小鼠結(jié)腸隱窩深度。

圖3 結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分

2.3 屎腸球菌G2對(duì)小鼠器官指數(shù)的影響 小鼠器官指數(shù)的結(jié)果見(jiàn)表3。小鼠器官指數(shù)的結(jié)果表明，試驗(yàn)各組器官指數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；相同的，小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)各組間均不存在顯著性差異（P＞0.05）。

表3 屎腸球菌G2對(duì)小鼠器官指數(shù)的影響

2.4 屎腸球菌G2對(duì)小鼠腸道免疫功能的影響如圖4所示，小鼠結(jié)腸抗菌肽Reg3β和Reg3γ基因mRNA表達(dá)量各組之間差異不顯著（P＞0.05）。ENT組TNF-αmRNA的表達(dá)水平顯著低于CON組（P=0.024），表明灌胃屎腸球菌G2菌液一定程度上有緩解小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的作用。

圖4 腸道免疫因子的表達(dá)

3 討論

3.1 屎腸球菌G2對(duì)小鼠腸道微生物的影響 研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以影響腸道菌群的組成及其豐度，提高有益菌的含量降低有害菌，其作用途徑主要是菌膜屏障，分泌抑菌素和有機(jī)酸以抑制有害菌的生長(zhǎng)，與有害菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)等（譙仕彥等，2014；王永等，2013）。候成立等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加植物乳酸桿菌可以增加乳酸菌的數(shù)量，顯著降低大腸桿菌的數(shù)量。方偉（2017）也得到相似結(jié)果。董曉麗（2013）研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B27對(duì)斷奶仔豬糞便中乳酸菌、芽孢桿菌數(shù)量無(wú)顯著性影響，但大腸桿菌數(shù)量顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)健康小鼠灌胃腸球菌活菌能夠顯著增加小鼠腸道益生菌乳酸菌的數(shù)量，但隨著時(shí)間的推移，腸道乳酸菌的數(shù)量又會(huì)回歸到正常水平，結(jié)腸內(nèi)容物中腸球菌、乳桿菌和大腸桿菌的數(shù)量沒(méi)有顯著改變。以上結(jié)果說(shuō)明，屎腸球菌G2只能在短暫時(shí)間內(nèi)增加腸道益生菌乳酸菌的數(shù)量，而對(duì)腸道有害菌大腸桿菌的數(shù)量沒(méi)有影響，這表明屎腸球菌G2符合過(guò)路菌的特征，其不具備持續(xù)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的能力，即屎腸球菌G2并未在小鼠腸道中定植或并未形成優(yōu)勢(shì)菌群，故對(duì)健康小鼠腸道菌群的構(gòu)成無(wú)顯著影響。

3.2 屎腸球菌G2對(duì)小鼠腸道形態(tài)的影響 研究表明，乳酸菌有助于改善腸道結(jié)構(gòu)，提高動(dòng)物機(jī)體消化和吸收效率。糞腸球菌等乳酸菌能夠降低肉雞的腸道隱窩深度，促進(jìn)肉仔雞小腸絨毛生長(zhǎng)（王利紅，2014；徐基利，2011）。王曉成（2017）研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能顯著降低小鼠隱窩深度。本研究發(fā)現(xiàn)，灌胃腸球菌活菌或熱滅活菌對(duì)健康小鼠的腸道病理學(xué)方面沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，灌胃腸球菌活菌能增加小鼠腸道杯狀細(xì)胞的數(shù)量，但不存在顯著性。而在結(jié)腸隱窩深度方面，灌胃屎腸球菌活菌顯著增加了健康小鼠的隱窩深度。隱窩深度與腸上皮細(xì)胞的增殖和凋亡兩個(gè)過(guò)程的速率有關(guān)系。隱窩變深可能是腸上皮細(xì)胞增殖速率加快，凋亡速率變慢，使細(xì)胞熟度增加、細(xì)胞分泌能力增強(qiáng)（王曉成，2017；李雨宸，2015）。因此，屎腸球菌G2有可能會(huì)增強(qiáng)腸黏膜上皮的分泌功能。Yan等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，益生菌產(chǎn)生的可溶性蛋白能間接作用于結(jié)腸上皮細(xì)胞，抑制上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促使隱窩加深。因此，屎腸球菌G2促進(jìn)小鼠腸道隱窩加深的機(jī)理仍有待驗(yàn)證。

3.3 屎腸球菌G2對(duì)小鼠腸道免疫功能的影響肝臟不僅僅是一個(gè)消化代謝的器官，還是一個(gè)重要的免疫器官，含有豐富的免疫細(xì)胞（閆蕾等，2009），脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，肝、脾器官指數(shù)可以反映機(jī)體的免疫水平。關(guān)于益生菌對(duì)動(dòng)物機(jī)體器官指數(shù)影響的報(bào)道不盡相同，唐志剛（2010）研究發(fā)現(xiàn)，肉雞日糧中添加益生菌可以顯著提高肉雞的脾臟指數(shù)。朱惠（2016）研究發(fā)現(xiàn)，牦牛源腸球菌Swun3對(duì)小鼠臟器指數(shù)無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃屎腸球菌活菌對(duì)健康小鼠器官指數(shù)、肝臟指數(shù)有一定程度的影響但不顯著。造成這一差異的原因可能與試驗(yàn)所用菌種和施加劑量不同有關(guān)。

腸道不僅僅是消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的器官，同時(shí)具有內(nèi)分泌和免疫的功能（鄒立軍等，2017）。益生菌對(duì)腸道免疫因子的分泌有不同程度的影響。腸免疫系統(tǒng)受到刺激后，腸相關(guān)淋巴組織能分泌免疫球蛋白、白介素等分子來(lái)維持腸道環(huán)境的穩(wěn)態(tài)（譙仕彥等，2014）。這其中胰島再生源蛋白（Reg）、腫瘤壞死因子（TNF-α）與黏蛋白（Mucin）在腸道黏膜免疫中發(fā)揮著重要的作用。Reg與腸道炎癥的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系（李雨辰，2015）。李雨辰（2015）研究表明，乳酸菌可以增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞Reg3γ的分泌，且一定劑量的乳酸菌干預(yù)結(jié)腸炎小鼠可以緩解小鼠體內(nèi)的炎癥水平。TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是典型的促炎因子。黃怡（2012）研究發(fā)現(xiàn)，斷奶前仔豬灌服屎腸球菌EF1可以顯著增加空腸黏膜TNF-α表達(dá)量，并且能顯著降低回腸黏膜TNF-α的表達(dá)量。MUC2由腸道杯狀細(xì)胞分泌，是腸道中最豐富的黏蛋白，可以抑制病原微生物的黏附定植（譙仕彥等，2014；楊利娜等，2014）。Reg3β與Reg3γ是小鼠腸道抗菌肽，在炎癥狀態(tài)下表達(dá)量顯著增加以起到抑制炎性反應(yīng)的作用。本試驗(yàn)結(jié)果中，灌胃屎腸球菌G2活菌對(duì)健康小鼠抗菌肽Reg3β和Reg3γ表達(dá)量沒(méi)有影響，說(shuō)明腸球菌G2對(duì)腸道無(wú)免疫刺激的作用。而促炎因子TNF-α表達(dá)量顯著降低，表明腸球菌G2能一定程度緩解炎癥，增強(qiáng)健康小鼠腸道黏膜免疫耐受作用，具備益生特性。試驗(yàn)處理各組小鼠黏蛋白MUC2表達(dá)量不存在差異，這與結(jié)果中所涉及的杯狀細(xì)胞數(shù)量各組差異不顯著的結(jié)果相符。綜上所述，牦牛腸黏膜來(lái)源屎腸球菌G2能在一定程度上降低健康小鼠腸道炎性反應(yīng)水平，并具備促進(jìn)腸道健康的益生效果。結(jié)腸抗菌肽Reg3β、Reg3γ和黏蛋白MUC2在短期急性試驗(yàn)中并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異，可能屎腸球菌G2在炎癥模型小鼠身上會(huì)有較好的益生表現(xiàn)，這方面仍需后續(xù)試驗(yàn)繼續(xù)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

牦牛腸黏膜源屎腸球菌G2在短期灌胃后能顯著增加小鼠腸道乳酸菌總菌的數(shù)量，增加腸黏膜隱窩深度，并降低腸道促炎性細(xì)胞因子TNF-α的mRNA表達(dá)水平，在一定程度上具有改善腸道形態(tài)和促進(jìn)腸道健康的作用。