薛潤苗，楊文彬，史向華，陳磊，趙靜宇，李百強，柴秋彥

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006）

維生素D3（Vitamin D3，VD3）的經(jīng)典生物學(xué)作用是調(diào)節(jié)鈣磷平衡，維持骨骼健康[1]。目前，VD3的臨床應(yīng)用廣泛，但長期安全劑量尚未確定，不良反應(yīng)事件時有發(fā)生，特別是對腎功能有損害，可引起腎功能衰竭，導(dǎo)致死亡。腎臟是VD3代謝的重要器官，有學(xué)者指出血清VD3水平是多種慢性腎臟疾病進(jìn)展的獨立預(yù)測因素[2]。VD3腎毒性多因為使用不當(dāng)，或是在治療佝僂病的過程中反復(fù)大量使用所致[3]。為探討VD3劑量與腎毒性之間的關(guān)系，本研究以大鼠為研究對象，比較觀察不同劑量VD3對大鼠血清腎功能指標(biāo)及腎組織病理學(xué)的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

健康SD大鼠100只，雄雌各半，體質(zhì)量180～200 g，6周齡；SPF級，購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2009-0017。飼養(yǎng)于山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院藥理研究室屏障動物房，實驗動物使用許可證號：SCXK(晉)2010-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后使用。

1.2 實驗藥品與試劑

VD3注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：20100106，規(guī)格：7.5 mg/mL），根據(jù)需要稀釋后使用；玉米油市售；2 mol/L硫酸；10%碘化鉀溶液；0.002 mol/L 高錳酸鉀溶液；10%硫酸錳溶液；3%鉬酸銨溶液；0.5%淀粉溶液；甲醛(上海滬試，分析純AR)；無水乙醇(北京試劑，優(yōu)級純GR)；0.9%氯化鈉注射液(山東華魯制藥有限公司)；BUN測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130416）；CRE測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130416）；血Ca2+測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：2010416）。

1.3 實驗儀器設(shè)備

離心機；顯微鏡；電子天平(北京賽多利斯，BT2202S 型)；全自動五分類動物專用血液分析儀(HEMAVET 950 型)；全自動生化分析儀（SELECTA-E型，荷蘭威圖）；病理切片機（德國徠卡，TS6016+CV6030 型）；酶標(biāo)儀（SPR-960型，長春賽諾邁德醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 分組

將100只SD大鼠隨機分為對照組、VD3低劑量組、VD3中劑量組、VD3大劑量組、VD3超大劑量組，各20只，雌雄各半；大鼠在實驗前不禁食，不禁水。

2.2 維生素D3的配制

取標(biāo)示濃度為7.5 mg/mL的VD3注射液，采用等量遞增稀釋法，以玉米油為溶劑分別配成所需濃度的VD3溶液（按照給藥劑量進(jìn)行換算配制，低、中、高、超高劑量組分別給藥20 IU/kg、80 IU/kg、200 IU/kg、800 IU/kg），每天在灌胃前新鮮配制。

2.3 動物給藥方式、劑量和時程

采用常規(guī)灌胃方式給藥，VD3不同劑量組給予配制好的VD3溶液。每日灌胃（ig）一次，給藥體積為0.5 mL/100g；連續(xù)6周。對照組給予同體積的生理鹽水。

2.4 標(biāo)本采集

2.4.1 血清樣本采集： 禁食過夜后稱量體質(zhì)量，以乙醚麻醉大鼠，腹主動脈采血，血樣在室溫下以3 000 r/min離心10 min，取血清4℃條件下保存。

2.4.2 光鏡標(biāo)本采集： 采血后放血處死大鼠，剪開腹腔，取左腎橫切，右腎縱切，在冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，于10%福爾馬林溶液固定，24 h后換液，48 h后取材常規(guī)脫水、石蠟包埋，做成4 μm厚的切片，HE染色后行光鏡檢查。

2.5 樣本測定

2.5.1 體質(zhì)量測定： 灌胃前、灌胃3 w、6 w后分別以感量1/100電子天平稱量各組大鼠體質(zhì)量；

2.5.2 血清生化指標(biāo)測定： 利用全自動生化儀測定各組血清尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)及Ca2+含量（按試劑盒說明測定）。

2.5.3 腎組織病理學(xué)檢： 光鏡下觀察腎小球、腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照記錄。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，并進(jìn)行方差齊性檢驗，組內(nèi)比較采用最小顯著差(LSD)法，P＜0.05為差異有統(tǒng) 計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 VD3對各組大鼠體質(zhì)量的影響

灌胃6 w后，各劑量組雌性大鼠體質(zhì)量同對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各劑量組雄性大鼠體質(zhì)量均大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、表2。

3.2 VD3對大鼠血清BUN、CRE及Ca2+含量的影響

五組BUN和CRE比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；VD3超大劑量組血清Ca2+含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表1 VD3對各組雌性大鼠體質(zhì)量的影響

表2 VD3對各組雄性大鼠體質(zhì)量的影響

表3 VD3對大鼠血清BUN、CRE及Ca2+的影響

圖1 VD3對大鼠腎臟組織病理學(xué)變化的影響（HE染色 10×20）

3.3 VD3對各組大鼠腎組織病理學(xué)的影響

與對照組比較，VD3各劑量組腎組織光鏡下觀察均沒有顯著改變。

4 討論

VD3作為脂溶性物質(zhì)，攝入劑量過大、應(yīng)用時間過長可造成中毒。臨床上VD3中毒診斷的主要依據(jù)為大劑量VD3攝入史、臨床表現(xiàn)、血清25（OH）D3水平增高以及血清鈣升高等[4]。VD3過量致25（OH）D3水平升高，但未導(dǎo)致高鈣血癥時，一般無任何臨床表現(xiàn)。只有當(dāng)血鈣升高時，才出現(xiàn)一系列高鈣血癥的臨床表現(xiàn)，VD3中毒相關(guān)的癥狀和表現(xiàn)與患者的年齡、血清鈣濃度及高鈣血癥的持續(xù)時間等密切相關(guān)[5]。VD3中毒可引起腎損害，因高鈣血癥的程度和病情發(fā)展快慢而各異[6]。

本實驗中持續(xù)給予大鼠不同劑量VD3，通過觀察大鼠體質(zhì)量變化、血中BUN、CRE、Ca2+含量、腎臟病理切片等，探討不同劑量VD3對大鼠腎毒性的影響。體質(zhì)量增長是反映實驗動物一般生理狀況的重要指標(biāo)，特別是在評價藥物毒性的實驗中，體質(zhì)量增長是必需考察的項目。本研究結(jié)果顯示，VD3用藥6周，VD3各劑量組雄性大鼠體質(zhì)量均大于對照組；說明VD3對大鼠的身體造成了一定程度的損傷，生理狀態(tài)發(fā)生改變。

本研究結(jié)果顯示五組血清BUN、CRE比較無明顯差異。課題組前期通過透射電子顯微鏡觀察大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，用藥6周時，與對照組比較，VD3各劑量組對腎小球組織結(jié)構(gòu)的影響以增生為主[7]。

血清Ca2+升高可以使大量鈣離子沉積于動物體內(nèi)多種組織器官，造成器官功能障礙甚至衰竭，故血清鈣離子的含量，是衡量中毒的敏感指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，超大劑量組血清Ca2+含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明VD3達(dá)到800 IU/kg時會使大鼠的血鈣水平顯著提高，產(chǎn)生毒性。

綜上所述，VD3在800 IU/kg給藥劑量，會引起大鼠血清Ca2+含量明顯升高，但腎組織結(jié)構(gòu)改變不大，對臨床合理使用VD3有重要的參考和指導(dǎo)意義。