連素梅，孫曉霞，婁巧哲，李軻，胡連霞，牛增元，郭會(huì)清

（1.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，河北 石家莊 050051；2.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，河南 鄭州 450003；3.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山東 青島 266555）

0 引言

我國(guó)是紡織工業(yè)大國(guó)，也是全球棉花最大消費(fèi)國(guó)，對(duì)棉花的需求量很大，僅靠國(guó)內(nèi)棉花生產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足紡織工業(yè)的需求，因此每年需要通過(guò)進(jìn)口棉花來(lái)彌補(bǔ)短缺，且進(jìn)口數(shù)量很大。據(jù)國(guó)家質(zhì)檢總局統(tǒng)計(jì)，近三年我國(guó)從世界各國(guó)進(jìn)口棉花12152批、312萬(wàn)噸，貨物總值56億美元，經(jīng)檢驗(yàn)共計(jì)對(duì)外索賠8752萬(wàn)美元，占貨值的1.5%，為國(guó)家和企業(yè)挽回了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)進(jìn)口棉花主要來(lái)自美國(guó)、澳大利亞、印度、烏茲別克斯坦、巴西、貝寧、布基納法索、希臘等，由于進(jìn)口棉花產(chǎn)地不同以及種植、采摘、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸方式不同，除品質(zhì)差異很大，隨附著棉花攜帶來(lái)的各種有害生物也五花八門，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)及接觸人員危害很大[1]，但并未引起相關(guān)部門高度重視。因此，作者重點(diǎn)對(duì)美國(guó)、澳大利亞等主要國(guó)別的進(jìn)境棉花針對(duì)霉菌種類及含量進(jìn)行分析，并提出安全防范措施。旨在促進(jìn)棉花貿(mào)易的科學(xué)健康發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品

2017年進(jìn)境的美國(guó)棉花樣品（M-USA）和澳大利亞棉花樣品（M-AUS）。

1.2 試劑

無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，無(wú)菌生理鹽水，孟加拉紅瓊脂，馬鈴薯葡萄糖瓊脂，營(yíng)養(yǎng)瓊脂，核酸提取試劑盒。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平，拍擊式均質(zhì)器，恒溫培養(yǎng)箱，生物安全柜，全自動(dòng)微生物分析儀，全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，高速冷凍離心機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

從無(wú)菌采集的棉花樣品中稱取25 g裝入無(wú)菌袋中，倒入225 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，拍擊均質(zhì)2 min，即為10倍的樣液，再用無(wú)菌生理鹽水按照10倍的梯度稀釋，分別得到100倍和1000稀釋倍數(shù)的樣液。每個(gè)稀釋梯度各吸取1 mL樣液于3個(gè)無(wú)菌平皿中，分別傾注45℃的孟加拉紅瓊脂（培養(yǎng)出來(lái)的為霉菌），馬鈴薯葡萄糖瓊脂（培養(yǎng)出來(lái)的為霉菌）和營(yíng)養(yǎng)瓊脂（培養(yǎng)出來(lái)的為細(xì)菌），混勻凝固，各做2個(gè)平行。孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板于28℃培養(yǎng)5d；營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板于36℃培養(yǎng)48 h。觀察記錄計(jì)數(shù)結(jié)果，結(jié)果取兩個(gè)平行的平均值。挑取各平板上的特征單菌落進(jìn)行分離純化，通過(guò)全自動(dòng)微生物分析儀（VITEK 2.0）、全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（MALDI-TOF）以及基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。

按照樣品霉菌數(shù)=[(孟加拉紅瓊脂菌落數(shù)+馬鈴薯葡萄糖瓊脂菌落數(shù))/2]×稀釋倍數(shù)；樣品細(xì)菌數(shù)=營(yíng)養(yǎng)瓊脂菌落數(shù)×稀釋位數(shù)；進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和換算。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

美國(guó)及澳大利亞棉花樣品菌落培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果參見表1。根據(jù)表1計(jì)算得出，美國(guó)棉花樣品的霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果為45 CFU/g，細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果為110 CFU/g；澳大利亞棉花樣品的霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果為270 CFU/g，細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果為720 CFU/g。

分別從美棉和澳棉的2個(gè)棉花標(biāo)準(zhǔn)樣品中分離出霉菌5株，芽孢桿菌3株。經(jīng)過(guò)全自動(dòng)微生物分析儀（VITEK 2.0）、全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（MALDI-TOF）以及基因測(cè)序鑒定，這5株霉菌為黃曲霉、黑曲霉、阿曲霉、土曲霉、謝瓦利埃曲霉；芽孢桿菌分別為短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌。因棉花樣品養(yǎng)分較為單一，霉菌主要是以孢子形態(tài)存在，芽孢桿菌則主要以芽孢形態(tài)存在[2]。

4 菌落形態(tài)與危害分析

從棉花采摘、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸方式來(lái)講，在世界主要產(chǎn)棉國(guó)中，美國(guó)和澳大利亞的條件應(yīng)該說(shuō)是最好的，即便如此，在這兩個(gè)國(guó)別進(jìn)境的棉花中，還發(fā)現(xiàn)了上述霉菌，其他國(guó)家的加工、儲(chǔ)存方式以及衛(wèi)生狀況相對(duì)差距很大，棉花中的霉菌狀況更為堪憂。曲霉菌是一種典型的絲狀菌，主要是靠散發(fā)在空氣中的孢子增殖，具有很強(qiáng)的繁殖能力，因此曲霉菌對(duì)人類的危害較大，特別是對(duì)眼部很容易引起各種感染[3]。

4.1 黃曲霉

黃曲霉為半知菌亞門叢梗孢科曲霉屬，且為需氧菌，最適溫度30℃～33℃，相對(duì)濕度80%～90%為最佳條件。菌落形態(tài)是最初帶黃色，然后變?yōu)辄S綠色，老后顏色變暗，平坦或有放射狀溝紋，反面無(wú)色或帶褐色。在低倍顯微鏡下觀察可見分生孢子頭疏松放射狀，繼變?yōu)槭杷芍鶢?。分生孢子梗多從基質(zhì)生出，長(zhǎng)度一般小于1 mm。有些菌絲產(chǎn)生帶褐色的菌核。分生孢子球形、近球形或稍作洋梨形，粗糙。黃曲霉會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素，是一種有致癌性且有劇烈毒性的化合物。

表1 不同稀釋度下的菌落培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果

4.2 黑曲霉

黑曲霉為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種。廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中。生長(zhǎng)適溫37℃，最低相對(duì)濕度為88%，能引致水分較高的糧食霉變和其他工業(yè)器材霉變。在高溫、高濕環(huán)境下，黑曲霉容易大量生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)酶生熱，侵染棉花時(shí)引起落花或爛鈴，或生于多汁的果實(shí)上，引起腐爛或軟腐，侵染洋蔥鱗片表面生出大量黑粉；梅雨季節(jié)亦容易引起衣物發(fā)霉等。黑曲霉菌絲直徑15～20 pm，長(zhǎng)約1～3 mm，壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」?，小梗上長(zhǎng)有成串褐黑色的球狀物，直徑2.5～4.0μm。分生孢子頭球狀，直徑700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無(wú)色或中央略帶黃褐色。有的菌株還可將羥基孕甾酮轉(zhuǎn)化為雄烯。菌絲呈黑褐色，頂囊大球形，小梗雙層，分生孢子為球形，呈黑褐色，平滑或粗糙。由于該菌生長(zhǎng)快速，極易通過(guò)空氣擴(kuò)散污染環(huán)境，對(duì)棉花接觸及檢驗(yàn)人員均構(gòu)成威協(xié)。國(guó)內(nèi)關(guān)于黑曲霉對(duì)人體致病性方面的研究較少，目前所見到的公開報(bào)道是福建省衛(wèi)生防疫站與廈門市同安區(qū)肝癌研究所關(guān)于同安地區(qū)肝癌的高發(fā)病率與黑曲霉等曲霉菌的產(chǎn)毒較大有關(guān)。

4.3 土曲霉

土曲霉屬于半知菌綱，殼霉目，杯霉科。菌落生長(zhǎng)快，菌落小、圓形，呈肉桂色或土黃色。分生孢子頭致密圓柱狀，分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)而扭曲，頂囊半球狀。分生孢子球形或近球形，壁光滑，孢子圓形到卵圓形。如果不小心耳道被土曲霉感染了，會(huì)出現(xiàn)中耳炎，出現(xiàn)耳鳴或腫漲等癥狀，如果肺部被土曲霉感染了，易引發(fā)肺炎。

4.4 芽孢桿菌

芽孢桿菌原來(lái)是獨(dú)立生存的生物。世界上有很多種芽孢桿菌，它們就生活在土壤中，對(duì)人對(duì)動(dòng)物都沒(méi)有什么危害，如上述進(jìn)境棉花樣品中檢出的短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌等。但炭疽芽孢桿菌危害很大，原因是它們除了染色體之外，還在進(jìn)化過(guò)程中獲得了額外的遺傳物質(zhì)。在炭疽芽孢桿菌中，那是兩種不同的質(zhì)粒。這種細(xì)菌產(chǎn)生兩種毒素，一種叫致死因子，另一種叫水腫因子。這可能是最厲害的細(xì)菌毒素，只要有一個(gè)分子進(jìn)入細(xì)胞，就能使細(xì)胞破裂死亡。正由于這些毒素，食草動(dòng)物感染炭疽后，才會(huì)那么快死亡；也由于毒素破壞了血管的細(xì)胞，才會(huì)那么嚴(yán)重的出血，把細(xì)菌帶出體外，造成無(wú)法控制的污染。

5 安全防范措施

一是接觸棉花人員應(yīng)佩戴手套，檢驗(yàn)人員應(yīng)帶好口罩、眼罩等防護(hù)用品，加強(qiáng)保護(hù)措施。二是工作結(jié)束后應(yīng)及時(shí)洗手、清理眼睛，做到清潔，必要時(shí)進(jìn)行消毒處理。三是一旦引起不適或感染炎癥，應(yīng)積極治療，將危害降到最低。