周冰 張如平

(貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，貴州 貴陽 550003)

血紅蛋白A是由4個亞鐵血紅素和2對α和 β珠蛋白鏈構成的四聚體。而血紅蛋白A1 c則是血紅蛋白A的 β鏈末端氨基酸殘基與葡萄糖結合而成的HbA1 c。HbA1 c是由分兩個階段的非酶糖化反應所生成。第一步由葡萄糖和血紅蛋白結合形成可逆的醛亞胺中間產物(不穩(wěn)定型A1 c)，而后經過較長時間的不可逆反應形成穩(wěn)定的基酮氨(穩(wěn)定性A1 c)，這個最終產物也就是現(xiàn)在通常所檢測的HbA1 c。我科于2017年購買一臺HLC-723G8全自動糖化血紅蛋白(HbA1 c)分析儀，通過一年多的臨床應用，在這里我們對HbA1 c檢測結果構成的影響相關因素進行探討。

1 影響因素

1.1 檢驗方法 HbA1 c測定方法的原理有多種：(1)根據(jù)HbA1 c與Hb的電荷差異，如離子交換層析法、高效液相層析法(HPLC)、電泳和等電聚焦電泳法;(2)根據(jù)Hb上糖化集團結構差異，如親和層析、免疫測定法、離子捕獲法和酶法; (3)化學分析，分光光度法、比色法。

高效液相層析法(HPLC)是在全血狀態(tài)下測試，酶法或免疫法則是將血液離心后從紅細胞層進行采樣。測定方法不同對HbA1 c的檢測結果所產生的干擾也不同。

1.2 不穩(wěn)定產物對檢測的影響 L-A1c是HbA1 c在進行初期反應時所產生的一種產物，結構不是十分穩(wěn)定，會隨血糖濃度的變化而變化，可水解為葡萄糖和Hb，也可生成更穩(wěn)定的醛胺。該物質不能對平均血糖的濃度進行反映，但可對HbA1 c的測定結果產生影響[1]。硼酸鹽親和色譜法和免疫法不對L-A1c進行檢測，所以不會受其影響[2]。離子交換色譜法和電泳法受該物質的影響相對較大，有研究發(fā)現(xiàn)該物質可使離子交換色譜法測定得到的HbA1 c值比實際值高出1.5%左右[3]。最簡單去除該物質的方法是將樣本用溶血劑進行處理，將溶血產物在37 ℃水浴箱中孵育6 h左右[4]。

1.3 Hb變異體對檢測的影響 HbF不會對離子交換色譜法和親和色譜法的檢測結果產生影響，而免疫法易受到HbF的干擾。研究發(fā)現(xiàn)即使HbF濃度在15%以上，Bio-Rad VariantⅡ和Tosoh G7兩種離子交換層析柱也不會受到太大的影響[5]。但CLC330/385親和層析柱法的測定結果會比實際值低，尤其當HbF在20%以上時，測得的HbA1 c值會下降1%左右，甚至更多。該物質對CLC330/385親和色譜法所產生的干擾比較多，可能是由于HbF的糖化速率相對較慢。HbF可以使DCA-2000免疫法的測定值較實際值低，因為在HbF分子中HbA的β鏈被γ鏈所取代[6]。

1.4 常見的化學衍生物對檢測結果的影響 氨基甲酰Hb在患有尿毒癥的患者血液中的濃度會明顯升高，是最常見的對HbA1 c檢測結果造成干擾的化學衍生物[7]。尿素在患者體內可自發(fā)形成氨和氰酸鹽化合物，氰酸鹽經過質子化作用后可以形成異氰酸，該產物與蛋白質的α和ε氨基基團反應可以形成氨基甲酰。Hb的β鏈的N端上的纈氨酸與異氰酸發(fā)生結合反應形成氨基甲酰Hb[8]。該物質與HbA1 c的等電點比較相似，故可對依據(jù)電荷原理對HbA1 c的水平進行測定的方法形成一定的干擾。電泳法對氨基甲酰Hb的反應非常敏感。在患者的體內，氨基甲?；腍b的濃度如果在5.4%以上時，就會導致采用離子交換法測定得到的HbA1 c值比真實偏高[9]。

1.5 影響紅細胞生存時間的因素對檢測結果的干擾 HbA1 c在患者的紅細胞內的合成進程是連續(xù)進行的， 但是速度一般情況下比較緩慢，任何一種能夠導致機體內的紅細胞壽命明顯縮短的疾病都會使HbA1 c形成的時間顯著縮短，使得檢測所得到的最終結果受到一定程度的影響。由于某些基礎性疾病多導致的繼發(fā)性溶血現(xiàn)象，往往會導致該項檢測所得到的最終結果明顯偏低，例如患有肝硬化、脾腫大等疾病的患者。此外采用EPO(促紅細胞生成素)進行治療及處于極度貧血狀態(tài)下的患者采用輸血的方法進行治療，也會對HbA1 c的檢測結果造成很大的影響[10]。

1.6 藥物的影響 維生素E可對Hb的糖基化產生十分明顯的抑制效果，使測定所得到的最終結果出現(xiàn)假性降低現(xiàn)象。相關研究結果顯示，患有缺鐵性貧血的患者在血糖的濃度相對恒定、紅細胞數(shù)顯著減少的情況下，HbA1 c的測定值會顯著升高，用鐵劑(100 mg/d)對該類患者治療3個月之后，由于幼紅細胞的出現(xiàn)使得Hb的濃度顯著降低，可以使HbA1 c平均值由7.0%下降至6.0%左右[11]，使測定所得到的最終結果出現(xiàn)假性降低現(xiàn)象。利巴韋林引起的溶血，使紅細胞壽命縮短導致HbA1 c結果降低。血透病人的HbA1 c會下降，(但是用含葡萄糖的透析液作血透的腎衰病人會增高)。 采用EPO(促紅細胞生成素)進行治療時， 大量的紅細胞增生，蛋白總量快速增加，而HbA1 c仍然以緩慢的速度生成，其與Hb總面積的百分比就相對偏低，導致HbA1 c結果偏低。

1.7 貯存溫度對檢測結果的影響 HbA1 c穩(wěn)定性好，標本即使在室溫下放置3～14 h也不會明顯影響測定結果。潘月等[12]對不同溫度條件下儲存的全血標本進行了檢測，全血標本4～8℃保存第7天時，所測得結果顯著低于新鮮標本。在-20 ℃下儲存第28天時，所測得結果也顯著低于新鮮標本。因此，若全血標本不能及時測定，需將其放置4～8 ℃保存，并最好在15 h內進行測定，此時HbA1 c檢測結果變異率<3%。在室溫的條件下，樣本的穩(wěn)定性相對較差。

1.8 標本的質量 在HLC-723G8全自動HbA1 c分析儀的檢測結果中有Total Area的信息，這是與注入層析柱的血液樣本中總血紅蛋白成比例的數(shù)值。Total Area應保持在適當?shù)姆秶Ｈ绻⑷氲难哼^于稀薄，Total Area過低會導致HbA1 c檢測結果偏低。反之，如果血液過于濃稠，Total Area過高則會導致HbA1 c檢測結果偏高，而通常在這種情況下，檢測結果的增高可能會達0.5%～1%，甚至會導致層析柱的損傷。

1.9 抗凝劑乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)的影響 抗凝管測定HbA1c作為標準用管。抽血量1～3 mL，混勻，無凝塊，抗凝管無破損。有報道使用肝素抗凝，結果會偏高。

1.10 某些疾病的影響 例如肝硬化：肝臟能使血糖濃度保持恒定，當餐后血糖濃度升高(>8.25 mmol/L)時，肝細胞迅速攝取葡萄糖并將其合成肝糖原貯存起來，當空腹時糖濃度降低至(<3.9 mmol/L)，肝糖原迅速分解生成葡萄糖補充血糖，還能進行糖異生參與血糖的調節(jié)， 肝硬化病人的血糖調節(jié)功能下降，常常會出現(xiàn)低血糖，從而導致HbA1 c生成偏低。

1.11 其他影響因素 年齡、種族、性別、空腹血糖、餐后2 h血糖等均是HbA1c測定準確性的獨立影響因素。HbA1c與空腹血糖呈正相關，而空腹血糖水平隨年齡增長有所增高，HbA1c檢測結果也隨之發(fā)生變化[13]。一般認為年齡與HbA1c值無關，但Pani[14]等對2473名正常人和3270 名血糖調節(jié)受損者進行HbA1c測定，在調查性別、體質量指數(shù)、空腹血糖、餐后2 h血糖等因素后，認為年齡每增加1 歲，HbA1c測定值升高0.03%。不同種族的HbA1c值不同， Herman[15]等對3819名血糖調節(jié)受損者測定， HbA1c 在調整年齡、性別、教育、婚姻、血壓等多項影響因素后，美國白種人、西班牙裔人、亞洲裔人、印第安人的HbA1c平均值分別為5.78% 、5.93% 、6.00%、6.18%， 差異具有統(tǒng)計學意義。

2 對 策

2.1 了解儀器的性能，減少誤差出現(xiàn) HbA1c測定方法不少，不同方法，原理不同，其影響因素也不相同。檢驗工作人員應了解檢測方法對于各種變異體檢測的局限性以及引起HbA1c假性升高或降低的因素，并在報告中為醫(yī)生作出提示。我院購進的HLC-723G8全自動HbA1c測定儀，其原理為高效液相層析法(HPLC)。測定HbA1c的百分含量，目前認為是分析HbA1c的金標準。要注意因血紅蛋白變異體引起的誤差。若遇到高度可疑地中海貧血和血紅蛋白病的病人，在發(fā)出報告前須仔細檢查色譜圖確認可能存在的血紅蛋白變異體，一旦發(fā)現(xiàn)結果出現(xiàn)偏差，可以采用變異模式，分離諸如HbS，HbC 等在HbAO峰后析出的變異血紅蛋白，通過其峰面積的補正而獲得更為準確的HbA1c檢測結果。另外，仔細閱讀廠商提供的使用說明書可避免發(fā)出一些不準確的結果。認真檢查有無異常色譜圖，提高操作儀器的技能和具備判斷圖譜的能力。

2.2 備注性檢驗報告 關注HbA1c的極度異常值以及HbA1c與血糖不一致的結果。如：對于某些血紅蛋白異常偏低，疑似貧血患者，可以通過備注系統(tǒng)提示臨床“該份標本檢測貧血，影響HbA1c檢測結果”。而對于血糖結果與HbA1c結果存在差異的樣本，同樣可以通過備注系統(tǒng)及時提醒臨床進行復查。受檢測儀器本身原理的影響，可能會受到異常血紅蛋白的干擾而異常增高或顯著偏低，對于此類樣本，也應給出更為詳盡的備注，內容包括提示存在異常血紅蛋白干擾，建議用免疫法檢測HbA1c，檢測血紅蛋白電泳等等。

因此，美國臨床生化學會(NACB)要求當HbA1 c>15%或低于參考區(qū)間下限時應重復測定一次(最好用不同原理的方法)，以確定是否有血紅蛋白變異體的存在[16]。

2.3 合理解釋特定病人的HbA1 c檢測結果 應清楚認識到某些藥物和某些疾病會造成HbA1 c假性升高或降低。其中部分藥物在臨床上使用十分廣泛，如服用水楊酸鹽、維生素C、阿片類藥物可引起假性升高。維生素E、病毒唑、α-干擾素可引起假性降低。某些疾病如：嚴重的高甘油三酯血癥，嚴重的高膽紅素血癥、尿毒癥、缺鐵性貧血、鉛中毒、長期飲酒均可引起假性升高。慢性腎病、肝硬化、妊娠初期可引起假性降低。當用HbA1c評估鐵、維生素B12或葉酸缺乏引起的貧血的糖尿病病人的血糖控制情況時，應充分考慮HbA1 c結果可能存在假性升高，不能真實反映病人的平均血糖水平。在做出任何醫(yī)療改變前應要求病人在餐前和餐后2h連續(xù)檢測毛細血管血糖水平數(shù)天，評估血糖自我監(jiān)測結果是否與期望的HbA1 c水平一致，以避免潛在的不適當?shù)闹委熀徒档偷吞茄Y的風險。

2.4 替代指標的選擇 在HbA1c不能準確反映血糖控制的情況下，使用替代指標是合適的選擇。這些指標包括果糖胺、糖化白蛋白、1，5-脫水葡糖醇(1，5-AG)和連續(xù)葡萄糖監(jiān)測(continuous glucose monitoring，CGM)。盡管果糖胺、糖化白蛋白、1，5-AG和CGM檢測與平均血糖水平相關，重要的是要記住只有HbA1c是通過驗證證明可作為評價長期血糖控制和并發(fā)癥形成風險的測量指標，因此HbA1c仍是測量血糖控制狀況的金標準，這些替代方法只能用于HbA1c結果不準確或誤導的情況，或對HbA1c進行補充[17]。

2.5 儀器的維護 常規(guī)的日常維護包括過濾器、層析柱的使用、更換，定期適時的校準。

3 小 結

HbA1 c是指示血糖控制情況的金標準，同時也是貫穿糖尿病診治過程中極為重要的管理基石。由于諸多因素均可以造成HbA1 c檢測值的假性升高或降低，因而開展HbA1 c檢測標準化工作極為重要。注重HbA1 c的檢測質量，進一步關注細節(jié)，重視檢測的所有過程，充分滿足分析中各個環(huán)節(jié)的質量要求，更多貫穿落實HbA1 c的標準化，確保為臨床提供更為準確、有效的檢測結果。