邢燕來 王曉磊

目前對原發(fā)性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)的治療仍以外科治療為主，但是其術后并發(fā)癥較多，患者預后狀況較差[1-2]。射頻消融技術(radiofrequency ablation，RFA)將射頻電極插入腫瘤中并輸出能量，提高細胞內(nèi)的溫度至90℃，從而毀損腫瘤細胞[3-4]。TACE術(transcatheter arterial chemoembolization)多用于治療肝癌[5-6]。新型長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度超過200 核苷酸(nucleotide，nt)的調(diào)節(jié)性非編碼 RNA，其在肝癌、喉癌和直腸癌中起關鍵作用[7-8]。本研究即探討新型長鏈非編碼RNA在肝癌中潛在的生物學功能和機制。

資料與方法

一、研究對象

選取2014年1月至2015年12月期間來我院就診的185例肝癌患者作為研究對象。所選185例肝癌患者中男性患者105例，女性患者80例，年齡48～78歲，平均年齡(64.30±5.17)歲。所有參試者均自愿簽訂同意書，配合參加本次研究。受試者分為試驗組和對照組，試驗組(n=95)實施冷循環(huán)射頻術聯(lián)合TACE術，對照組(n=90)實施傳統(tǒng)手術切除。入選標準：臨床診斷肝癌患者；無其他腫瘤疾病及免疫系統(tǒng)疾病病史；其他身體指標符合正常標準。剔除標準：近期做過大型手術；接受過放療或者化療等治療方法；不能配合完成試驗者。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，且受試者均已簽署書面知情同意書。

二、治療方法

(一)受試者實施冷循環(huán)射頻術聯(lián)合TACE術。即先給予患者TACE治療，使用Seldinger 行股動脈穿刺插管，于DSA下實施腫瘤供養(yǎng)動脈造影，選取吡喃阿霉素60 mg、碘化油30 mL混合乳化物行栓塞治療，然后導管灌注卡鉑300 mg。TACE治療1周后，再進行RFA 減瘤治療(LDRF-120S射頻消融治療儀)。RFA針刺入腫瘤中心，消融針展適合直徑，行重疊消融減瘤治療，消融范圍延伸周邊正常組織1 cm位置。收集患者的肝癌組織標本，采用熒光定量檢測的方法得到患者癌組織標本的RNA表達量[7-8]。對照組實施傳統(tǒng)手術切除腫瘤組織。

(二)采用應用q-PCR檢測(美國 Primerdesign公司Q-PCR試劑盒；用GAPDH基因作為內(nèi)參)方法檢測患者癌組織標本的長鏈非編碼RNA- AK054978及長鏈非編碼RNA- FER1L4在肝癌患者肝癌組織及癌旁組織中的表達水平。熱循環(huán)采用Tach-down程序：94℃ 5 min -(94 ℃ 20 s ～ 65 ℃ 1 min ～ 72 ℃ 2 min)1個循環(huán),然后退火溫度每循環(huán)降低1℃ ,降至61℃時進行36個循環(huán)。設定在每個循環(huán)72℃延伸后期收集熒光數(shù)據(jù)。熱循環(huán)完成后進行60℃～95℃的融解曲線測定。

(三)構建長鏈非編碼RNA- AK054978及長鏈非編碼RNA- FER1L4的質(zhì)粒，分別電轉染SMMC-7721人體肝癌細胞株(美國ATCC公司)。運用Transwell 小室(德國 默克密理博公司)實驗檢測肝癌細胞的組織生物學特性，對比分析癌細胞轉染后組織細胞遷移和細胞侵襲能力。Transwell 小室上室面用 Matrigel(50 mg/L)按 1∶8 稀釋液包被后以 FN 涂抹在小室下面并干燥，紫外線消毒 30 min。各孔加入 1% BSA 無血清培養(yǎng)基 0.1 mL，Matrigel充分浸潤后吸掉殘余培養(yǎng)基。制備細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整為 1×106個/mL，細胞懸液 0.2 mL(1×105)加于預包被培養(yǎng)板各孔，于下室緩慢加入 10 % FBS 培養(yǎng)基 0.5 mL，溫箱培養(yǎng) 16 h。用棉簽將 Transwell 小室上室面未穿過基底層膜的細胞擦去，注意不要破壞基底層膜，顯微鏡下進行計數(shù)細胞并比較。通過流式細胞儀(北京博奧CytoNova系列流式細胞儀)檢測各組肝癌細胞凋亡變化[7-8]。將待測細胞制成單細胞懸液，離心棄上清，沿管壁緩慢加入700 mL/L預冷 (-20 ℃)乙醇固定，上機檢測前RNA酶消化，再加入PI染色液，4 ℃避光30 min，使用FCM檢測凋亡率及細胞周期。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、試驗前，對所有肝癌患者的基本臨床資料進行調(diào)查統(tǒng)計，試驗組(n=95)，性別(男/女)為50/45，平均年齡為(50.32±8.96)歲；分化程度低者18例、分化程度中者32例、分化程度高者45例，淋巴轉移陽性者60例、淋巴轉移陰性者35例，遠處轉移陽性者51例、遠處轉移陰性者44例；對照組(n=90)，性別(男/女)為47/43，，平均年齡為(48.85±9.62)歲，分化程度低者16例、分化程度中者28例、分化程度高者46例，淋巴轉移陽性者57例、淋巴轉移陰性者33例，遠處轉移陽性者47例、遠處轉移陰性者43例。各組受試者的一般情況進行比較，結果顯示無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。此外，研究過程中所有受試者均完成了全部試驗，無中途退出者，亦無改用其他療法者。

二、TACE聯(lián)合射頻消融治療后CT顯示：射頻消融后復查，見病灶大范圍壞死，但是腫瘤內(nèi)側及外側均見結節(jié)狀強化，提示腫瘤有殘余。新型長鏈非編碼RNA(lncRNA)在肝癌患者癌組織中的表達量高于與其對應的癌旁組織。經(jīng)過β-actin均一化后，得到兩種lncRNA在不同組織中的相對定量(ΔCt= Ct lncRNA-Ct β-actin)。試驗組(n=95)：AK054978(Ct)為35.35，F(xiàn)ER1L4(Ct)為25.15，β-actin 為18.32，AK054978(ΔCt)為17.03±5.21，F(xiàn)ER1L4(ΔCt)為6.83±4.23；對照組(n=90)：AK054978(Ct)為32.26，F(xiàn)ER1L4(Ct)為30.36，β-actin 為19.01，AK054978(ΔCt)為13.25±4.87，F(xiàn)ER1L4(ΔCt)為為11.35±4.22。對比AK054978、FER1L4在兩種組織中的表達差異，肝癌組織中AK054978的表達明顯提高，屬于上調(diào)型(P<0.01)，相反，F(xiàn)ER1L4的表達顯著下降，屬于下調(diào)型(P<0.01)。

三、對肝癌患者癌組織的生物學功能進行檢測，發(fā)現(xiàn)AK054978 轉染組：細胞增殖(OD)為6.92，細胞凋亡(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)為1.68，發(fā)生細胞遷移者為50例，發(fā)生細胞侵襲者為38例；FER1L4轉染組：細胞增殖(OD)為3.89，細胞凋亡(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)為1.04，發(fā)生細胞遷移者為0例，發(fā)生細胞侵襲者為0例，即長鏈非編碼RNA- AK054978可以加速肝癌中細胞的繁殖，增強細胞遷移、侵襲能力；通過流式細胞儀觀察發(fā)現(xiàn)AK054978 轉染組凋亡率低、FER1L4轉染組凋亡率高，即上調(diào)長鏈非編碼RNA- AK054978的表達可以減少肝癌細胞凋亡。

討 論

RFA具有創(chuàng)傷很小，療效比較確切，并發(fā)癥少，住院時間短[9-10]。TACE可阻斷腫瘤的絕大多數(shù)血供，致使腫瘤缺氧，抑制腫瘤生長、促使腫瘤壞死[11]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，lncRNA被轉錄在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。lncRNA多具有內(nèi)在的RNA介導的功能轉化[12]。

ACE聯(lián)合經(jīng)皮肝穿射頻消融術(RFA)可明顯提高患者的1年和2年生存率；經(jīng)TACE聯(lián)合經(jīng)皮肝穿射頻消融術治療后患者的中位生存期明顯長于單獨TACE治療的患者，說明TACE聯(lián)合經(jīng)皮肝穿射頻消融術可在一定程度上延長患者的生命。

新型長鏈非編碼RNA在肝癌患者癌組織中的表達量高于與其對應的癌旁組織，與TNM分期、細胞分化、淋巴結的轉移有密切的關聯(lián)。為了研究新型長鏈非編碼RNA在肝癌中的潛在生物學功能特性及其分子機制，研究者建立兩種RNA表達量不同的肝癌穩(wěn)定轉染細胞，其中AK054978的表達明顯提高，屬于上調(diào)型；FER1L4的表達顯著下降，屬于下調(diào)型。將兩種RNA細胞分別導入癌細胞組織中，運用流式細胞技術、細胞劃痕實驗檢測肝癌細胞的組織生物學特性，發(fā)現(xiàn)上調(diào)lncRNA可以加速肝癌中細胞的繁殖，增強細胞遷移、侵襲能力。利用自噬抑制劑3-MA，通過流式細胞儀觀察兩種細胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)上調(diào)RNA的表達可以使肝癌中細胞發(fā)生自我吞噬從而減少細胞凋亡；經(jīng)倒置電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：下調(diào)RNA表達量的穩(wěn)轉細胞，細胞形態(tài)發(fā)生了變化，有逆轉的趨勢。長鏈非編碼RNA不僅只具有基因組轉錄的功能，還具備重要的細胞和分子生物學功能。其可通過影響基因組的轉錄過程和表觀遺傳信號改變腫瘤的發(fā)生發(fā)展，潛在的分子生物學功能主要有：調(diào)控蛋白活性、改變RNA的模式、調(diào)節(jié)轉錄模式等。

綜上所述，長鏈非編碼RNA的表達與肝癌的產(chǎn)生和發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系；冷循環(huán)射頻聯(lián)合TACE通過抑制新型長鏈非編碼RNA表達誘導肝癌細胞凋亡。