何永利, 黃澄, 周穎玲

廣東省心血管病研究所、廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)心內(nèi)科(廣東廣州 510080)

隨著感染性疾病治療的進(jìn)展，人類(lèi)壽命延長(zhǎng)，人類(lèi)與疾病的斗爭(zhēng)戰(zhàn)場(chǎng)已轉(zhuǎn)至慢性非傳染性疾病，其中以心腦血管疾病為主，其在我國(guó)和全球范圍均是人口死亡的首位原因[1-2]。無(wú)論是出于延長(zhǎng)壽命的永恒追求還是社會(huì)老齡化的醫(yī)療減負(fù)，對(duì)心腦血管疾病的機(jī)制研究始終熱度不減。隨著對(duì)疾病理解的逐步深入、高通量分子檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)和推廣[3]，以及生物信息學(xué)分析方法的發(fā)展，疾病機(jī)制的研究已進(jìn)入分子生物學(xué)時(shí)代。非編碼RNA因?yàn)樽陨硐鄬?duì)穩(wěn)定且不編碼蛋白質(zhì)而檢測(cè)內(nèi)容單一，其研究方興未艾，仍是目前疾病研究的熱點(diǎn)之一。目前已有許多研究者進(jìn)行心血管疾病的非編碼RNA研究并發(fā)現(xiàn)多種調(diào)節(jié)模式和多條調(diào)節(jié)軸，最為廣泛的是長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)-微小RNA(miRNA)-基因調(diào)節(jié)機(jī)制研究。

1 lncRNA、miRNA和mRNA的概念

1.1 lncRNA lncRNA最初是在2002年由Okazaki等[4]分析小鼠全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果中被首次提出來(lái)的，是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的調(diào)節(jié)性非編碼RNA[5]。之后隨著研究的進(jìn)展，lncRNA被報(bào)道在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[6]、擴(kuò)張型心肌病[7]、心肌梗死[8]和心力衰竭[9]等心血管疾病中發(fā)揮作用。常見(jiàn)地，lncRNA在基因印記[10]、染色質(zhì)重塑[11]、轉(zhuǎn)錄本剪接[12]、信使RNA(messenger RNA，mRNA)降解[13]和翻譯過(guò)程調(diào)控[14]等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)性作用，從而影響下游乃至疾病表型。

1.2 miRNA miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA[15-16]。miRNA不直接編碼蛋白質(zhì)行使生物功能，而一般是通過(guò)與mRNA的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)上的特定序列完全或不完全配對(duì)，直接降解mRNA或者抑制mRNA翻譯為蛋白質(zhì)，達(dá)到對(duì)mRNA或者該mRNA所對(duì)應(yīng)的基因(即靶基因)的調(diào)控。單個(gè)miRNA可有多個(gè)靶基因，而同一個(gè)靶基因又可由多個(gè)不同的miRNA調(diào)控[17]。

1.3 mRNA mRNA是經(jīng)基因轉(zhuǎn)錄后形成的并能進(jìn)一步翻譯成蛋白質(zhì)的一種單鏈核糖核酸，其長(zhǎng)度因基因而異。在原核生物的細(xì)胞質(zhì)中，一條mRNA可包含多個(gè)基因的遺傳信息，編碼多個(gè)蛋白質(zhì)；而在真核生物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，一條mRNA只包含一個(gè)基因的信息，只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)，翻譯過(guò)程更加精確。mRNA的蛋白質(zhì)編碼信息是從起始密碼子AUG開(kāi)始到終止密碼子的堿基序列，翻譯過(guò)程正是通過(guò)核糖體識(shí)別mRNA上的這種堿基序列而合成出特定的蛋白質(zhì)，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。mRNA的5′UTR位于AUG之前，3′UTR位于終止密碼子之后。

2 lncRNA、miRNA與mRNA的一般作用機(jī)制

2.1 miRNA調(diào)控mRNA的機(jī)制 miRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與mRNA的3′UTR中的特定序列結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控mRNA(或者間接地說(shuō)，調(diào)控其靶基因)的作用。miRNA在結(jié)合靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA的過(guò)程中[17]：(1)若與3′UTR 不完全匹配時(shí)，miRNA直接抑制mRNA的翻譯，但不影響mRNA的穩(wěn)定性；(2)若與3′UTR完全匹配時(shí)，miRNA降低mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)mRNA的降解，從而減少mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。以上兩種方式均最終導(dǎo)致特定的mRNA的翻譯減少，即靶基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的蛋白質(zhì)減少，表觀上表現(xiàn)為靶基因的表達(dá)下調(diào)。此外，另有報(bào)道證明，miRNA與mRNA不完全配對(duì)后除了阻遏mRNA翻譯外還可以促進(jìn)mRNA的3′端多聚腺苷酸尾巴的去除，加快3′核酸外切酶對(duì)mRNA的水解，降低mRNA的穩(wěn)定性[18]。

2.2 lncRNA和 miRNA之間相互調(diào)控 lncRNA和miRNA都是調(diào)控因子，兩者本身又可以相互作用、相互調(diào)控。

2.2.1 lncRNA對(duì)miRNA的調(diào)控 主要通過(guò)主要通過(guò)以下3種方式：(1)lncRNA作為miRNA的前體[19]：lncRNA通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的剪切作用形成miRNA的前體，或部分基因在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生lncRNA的同時(shí)產(chǎn)生miRNA；這些均為非成熟的miRNA，需進(jìn)一步加工生成成熟的miRNA，才能發(fā)揮調(diào)控靶基因的功能。(2)lncRNA與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mRNA[20]：有些lncRNA、miRNA均結(jié)合同一個(gè)mRNA的3′ UTR，lncRNA間接地競(jìng)爭(zhēng)性抑制了miRNA對(duì)靶基因的負(fù)向調(diào)控。(3)lncRNA的海綿效應(yīng)(miRNA sponge)[21]：即lncRNA可以通過(guò)“誘餌”的方式吸附一些特定的miRNA，以減少miRNA與mRNA的結(jié)合，影響了miRNA與mRNA的作用 ；具有該作用的lncRNA 被稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA (competing endogenous RNA，ceRNA)。

2.2.2 miRNA對(duì)lncRNA的調(diào)控 (1)直接作用：lncRNA 的轉(zhuǎn)錄成熟過(guò)程與mRNA類(lèi)似(包括RNA的剪接和編輯)，成熟的lncRNA通常也有Poly-A，即有5′ UTR和3′UTR；因此，類(lèi)似于作用于mRNA，miRNA也可以通過(guò)直接與lncRNA的3′ UTR不完全匹配，對(duì)lncRNA作負(fù)性調(diào)節(jié)[22-23]。(2)間接作用：lncRNA與miRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)存在著重疊；miRNA的基因座可位于編碼區(qū)或非編碼區(qū)基因組，lncRNA與miRNA在基因組中存在著物理位置的聯(lián)系。這些因素都是lncRNA、miRNA之間相互牽連、間接調(diào)控的基礎(chǔ)。

3 lncRNA-miRNA-基因調(diào)節(jié)機(jī)制在心血管疾病中的研究進(jìn)展

lncRNA與miRNA之間、miRNA與mRNA(或基因)之間，通過(guò)上述的調(diào)控機(jī)制形成了龐大的、錯(cuò)綜復(fù)雜的分子生物學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中，最經(jīng)典的調(diào)節(jié)模式是lncRNA-miRNA-基因調(diào)節(jié)軸。

3.1 眾多與心血管疾病相關(guān)的lncRNA、miRNA被發(fā)現(xiàn) Zangrando等[24]通過(guò)芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，相比于假手術(shù)組，心肌梗死組小鼠心肌組織標(biāo)本中有20個(gè)表達(dá)上調(diào)的lncRNA和10個(gè)表達(dá)下調(diào)的lncRNA(變異倍數(shù)大于2倍)。其中MIRT1(myocardial infarction-associated transcript 1)和MIRT2 這2個(gè)lncRNA顯著升高，且被qRT-PCR證實(shí)。

Yang等[25]用深度RNA測(cè)序的方法檢測(cè)了缺血性心力衰竭(以下簡(jiǎn)稱(chēng)心衰)、非缺血性心衰患者(各8例)在使用左室輔助裝置(LVAD)之前和之后心肌組織中的miRNA、mRNA以及l(fā)ncRNA的表達(dá)含量。同樣的，非心衰患者作為對(duì)照組(8例)也進(jìn)行了這些檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非心衰對(duì)照組，缺血性心衰組和非缺血性心衰組中分別檢測(cè)出160和147個(gè)差異性表達(dá)的miRNA，其中缺血性心衰組中有2個(gè)miRNA、非缺血性心衰組中有5個(gè)miRNA在使用左室輔助裝置之后表達(dá)水平恢復(fù)正常。RNA測(cè)序同樣在左室心肌標(biāo)本中共檢測(cè)了18 480個(gè)lncRNA，其中包括113個(gè)新型lncRNA。相較于非心衰對(duì)照組，缺血性心衰組中檢測(cè)出679個(gè)差異性表達(dá)的lncRNA，非缺血性心衰組中檢測(cè)出570個(gè)差異性表達(dá)的lncRNA，其中約有10%的lncRNA表達(dá)水平在使用左室輔助裝置后有所改善或者完全恢復(fù)正常。

Saddic等[26]通過(guò)RNA測(cè)序、qRT-PCR等方法在人的心肌組織標(biāo)本上檢測(cè)了心肌缺血前后13 871個(gè)lncRNA的表達(dá)含量變化，其中128個(gè)lncRNA在心肌缺血后有差異性表達(dá)。研究提示多種lncRNA與心肌缺血相關(guān)并且能很好地預(yù)測(cè)缺血程度。

3.2 心血管疾病中的lncRNA-miRNA-mRNA(或基因)調(diào)節(jié)軸 在發(fā)現(xiàn)心血管疾病中的差異性表達(dá)的lncRNA、miRNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了多條lncRNA-miRNA-mRNA(或基因)調(diào)節(jié)軸。

Wang等[28]發(fā)現(xiàn)，在心肌肥厚的病理生理調(diào)節(jié)中，Myd88是 miR-489的靶基因，受miR-489的負(fù)性調(diào)控。而心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)lncRNA(cardiac apoptosis-related lncRNA, lncRNA CHRF)作為一個(gè)內(nèi)源性的“海綿RNA”“吸附”miR-489，從而抑制了miRNA的活性，因此發(fā)現(xiàn)了CHRF-miRNA-489-Myd88調(diào)節(jié)通路。

在心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的無(wú)氧誘導(dǎo)的線粒體分裂和凋亡調(diào)節(jié)過(guò)程中，Wang等[29]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，lncRNA CARL具有miR-539的結(jié)合位點(diǎn)，CARL可特異性抑制miR-539。而miR-539與PHB2具有特異性結(jié)合位點(diǎn)，miR-539能夠特異性地負(fù)性調(diào)節(jié)抑制素2(prohibitin 2, PHB2)。最終，研究者總結(jié)出CARL-miR539-PHB2調(diào)節(jié)通路。

Jiang等[30]發(fā)現(xiàn)，在心肌肥厚的心肌重構(gòu)病理生理過(guò)程中，lncRNA-ROR特異性結(jié)合并負(fù)性調(diào)節(jié)miR-133。而另一方面miR-133又可抑制lncRNA-ROR的表達(dá)，且同時(shí)抑制心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦利鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、胎兒基因等心衰相關(guān)基因的表達(dá)。最終歸納出lncRNA-ROR-miR-133-心衰相關(guān)基因的調(diào)節(jié)通路。

4 展望

非編碼RNA與基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，lncRNA-miRNA-基因調(diào)節(jié)僅僅是該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一種簡(jiǎn)單模式。這種調(diào)節(jié)模式直觀、簡(jiǎn)潔，將來(lái)極有希望成為臨床干預(yù)疾病的理論工具。

隨著檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，檢測(cè)miRNA 和lncRNA 的方法越來(lái)越多、精度越來(lái)越高。在血漿、唾液、淚液、尿液、精液、羊水、母乳、漿膜腔積液、支氣管灌洗液、腦脊液等體液中均可檢測(cè)出miRNA和lncRNA，并且lncRNA、miRNA在體液環(huán)境中不被降解，符合作為生物標(biāo)志物的檢測(cè)穩(wěn)定性要求[27,31-32]。因此，miRNA、lncRNA有望成為疾病診斷和判斷預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，而miRNA 與lncRNA之間的調(diào)控關(guān)系也將因研究方法的改進(jìn)而被探索得更加透徹，并最終應(yīng)用于臨床。