李育敏，張水蘭，闞麗娟，湯花梅，熊 丹，許曉清，李方勇，張秀明

(深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳 518001)

臨床實(shí)驗(yàn)室在引進(jìn)新的測(cè)量程序，檢測(cè)患者標(biāo)本及出具患者檢測(cè)報(bào)告之前必須對(duì)檢測(cè)方法的分析性能進(jìn)行評(píng)估。按照ISO 15189:2012和CNAS-CL36:2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[1]，定量檢測(cè)方法和程序的分析性能驗(yàn)證應(yīng)包括精密度和正確度。2014年10月發(fā)布的美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) EP15-A3《用戶精密度驗(yàn)證和偏倚評(píng)估實(shí)驗(yàn)——批準(zhǔn)指南》為臨床實(shí)驗(yàn)室提供了最新的驗(yàn)證廠商聲明的測(cè)量程序精密度和正確度簡(jiǎn)便、有效的方法[2]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)CLSI EP15-A3用于臨床分子診斷測(cè)量程序的性能驗(yàn)證報(bào)道較少，本研究按照EP15-A3方案對(duì)熒光定量PCR法測(cè)定乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)進(jìn)行精密度驗(yàn)證和偏倚評(píng)估，為EP15-A3在臨床分子診斷定量檢測(cè)方法和程序分析性能驗(yàn)證的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1樣本測(cè)定 樣本為北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司提供的HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，高濃度水平(4.60E+06 IU/mL)批號(hào)為201609003，低濃度水平(1.41E+03 IU/mL)批號(hào)為201607003。按照廠家說明書進(jìn)行分裝保存于-15 ℃以下。

1.2試劑與儀器 試劑為湖南圣湘生物科技有限公司提供的HBV-DNA熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)2017012) 。儀器為羅氏cobas?z480全自動(dòng)熒光定量PCR分析儀。

1.3方法

1.3.1測(cè)定流程樣本檢測(cè)前校準(zhǔn)儀器，每天進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，質(zhì)控在控時(shí)數(shù)據(jù)可接受。按照EP15-A3要求，選擇高、低2個(gè)濃度水平樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定5次，持續(xù)5 d，每個(gè)樣本得到25個(gè)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1離群值檢驗(yàn) 將HBV-DNA檢測(cè)原始結(jié)果轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以便使數(shù)據(jù)更符合正態(tài)分布，消除指標(biāo)度量單位不同造成的不良影響。用Grubbs′法計(jì)算高、低2個(gè)濃度水平樣本所有測(cè)定結(jié)果對(duì)數(shù)值均在Grubbs′限值內(nèi)，無離群值。2個(gè)水平測(cè)定結(jié)果對(duì)數(shù)值的最大值和最小值見表1。

2.2精密度驗(yàn)證 高濃度水平的SR(CV，0.87%)≤σR(CV，5.00%)、SWL(CV，1.60%)≤σWL(CV，5.00%)；低濃度水平的SR(CV，3.79%)≤σR(CV，5.00%)、SWL(CV，4.83%)≤σWL(CV，5.00%)，精密度驗(yàn)證通過，見表2。

表1 Grubbs′法計(jì)算熒光定量PCR法測(cè)定HBV-DNA的離群值結(jié)果(Log IU/mL)

表2 熒光定量PCR法測(cè)定HBV-DNA的精密度驗(yàn)證結(jié)果(Log IU/mL)

表3 熒光定量PCR法測(cè)定HBV-DNA的偏倚評(píng)估結(jié)果(Log IU/mL)

2.3偏倚評(píng)估 高濃度水平均值為6.54 Log IU/mL，在VI(6.28～7.04 Log IU/mL)內(nèi)；低濃度水平均值為3.04 Log IU/mL，在VI(2.74～3.56 Log IU/mL)內(nèi)，正確度驗(yàn)證通過，見表3。

3 討 論

精密度是指在規(guī)定條件下，對(duì)同一或類似被測(cè)對(duì)象重復(fù)測(cè)量所得值或測(cè)得值間的一致程度，反映測(cè)量結(jié)果隨機(jī)誤差的大小，通常用不精密度表示[3]。精密度是檢測(cè)系統(tǒng)的基本分析性能之一和其他方法學(xué)性能評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)，如果精密度差，則無法進(jìn)行其他方法學(xué)性能評(píng)價(jià)。在CLSI的精密度評(píng)價(jià)指南中，EP10-A3是用于同時(shí)進(jìn)行線性、偏倚、精密度和樣本攜帶污染的初步評(píng)價(jià)[4],EP5-A3用于測(cè)量程序的精密度性能確認(rèn)及驗(yàn)證[5]。EP15-A3僅用于驗(yàn)證已經(jīng)建立的檢測(cè)方法精密度性能，而不適用于未建立精密度聲明的新方法分析性能的確認(rèn)，主要為臨床實(shí)驗(yàn)室提供一個(gè)簡(jiǎn)便、有效、可行的方法來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的不精密度是否與廠家聲明的一致，也適用于能力驗(yàn)證失敗后或者質(zhì)量檢測(cè)未通過，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)或校正后再次進(jìn)行精密度驗(yàn)證。性能指標(biāo)為SR和SWL。SR是指在一系列相同的測(cè)定條件下獲得的不精密度。測(cè)定條件包括相同的測(cè)定方法，相同的操作者，相同的測(cè)量系統(tǒng)，相同的操作條件，相同的地點(diǎn)，在一段較短的時(shí)期中重復(fù)測(cè)定相同或相似的分析物。SWL是指在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)和相同的操作者使用相同的儀器設(shè)備，校準(zhǔn)和試劑可以是變化的，得到的不精密度。

正確度是指無限多次重復(fù)測(cè)量的平均值與真值的一致程度，反映測(cè)量結(jié)果系統(tǒng)誤差的大小，通常用偏倚來度量[6]。用于正確度評(píng)價(jià)的CLSI指南有EP9-A3和EP15-A3。EP9-A3采用至少40份患者樣本進(jìn)行測(cè)量程序比對(duì)和偏倚評(píng)估，適用于實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)新的檢測(cè)系統(tǒng)或方法，更換新試劑或新儀器，與原有檢測(cè)系統(tǒng)或參考方法進(jìn)行比對(duì)，評(píng)價(jià)兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)或方法測(cè)定結(jié)果的偏倚是否在可接受范圍內(nèi)[7]。廠商或?qū)嶒?yàn)室開發(fā)新的測(cè)量程序，最好使用EP9-A3進(jìn)行比對(duì)及偏倚評(píng)估。EP15-A3采用有值參考物質(zhì)進(jìn)行偏倚評(píng)價(jià)，比對(duì)定值和測(cè)定結(jié)果，其樣本數(shù)量、重復(fù)次數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理較EP9-A3簡(jiǎn)單，適用于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)量程序的正確度確認(rèn)和驗(yàn)證。有值參考物質(zhì)包括有證參考物質(zhì)、參考方法定值分析物、PT和EQA定值分析物，這些物質(zhì)也適用于精密度驗(yàn)證。性能指標(biāo)為相對(duì)偏倚，即實(shí)驗(yàn)室確定允許偏倚，評(píng)價(jià)測(cè)量偏倚是否在允許偏倚范圍內(nèi)。

與EP15-A2相比，EP15-A3首先在重復(fù)測(cè)定次數(shù)上增加到5次，使重復(fù)性更可靠，其次，采用Grubbs′法進(jìn)行離群值檢驗(yàn)，使離群值判斷更簡(jiǎn)單客觀。第三，偏倚評(píng)估不再采用患者樣本進(jìn)行兩種方法的比較，僅利用有值參考物質(zhì)進(jìn)行比對(duì)，使驗(yàn)證方法更簡(jiǎn)便。第四，在偏倚評(píng)估數(shù)據(jù)分析中，EP15-A2判斷參考物質(zhì)靶值是否在測(cè)量均值驗(yàn)證區(qū)間內(nèi)，EP15-A3則判斷參考物質(zhì)測(cè)量均值是否在靶值驗(yàn)證區(qū)間內(nèi)，提高統(tǒng)計(jì)學(xué)效能[2，8]。

本研究按CLSI EP15-A3指南，對(duì)熒光定量PCR法測(cè)定HBV-DNA進(jìn)行精密度驗(yàn)證和偏倚評(píng)估。Grubbs′法檢驗(yàn)無離群值。高、低濃度水平樣本檢測(cè)均SR≤σR，SWL≤σWL，表明不精密度符合廠家聲明要求，精密度驗(yàn)證通過；高、低濃度水平測(cè)量均值均在VI內(nèi)，表明測(cè)量偏倚與允許偏倚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，測(cè)量偏倚在允許偏倚范圍內(nèi)，正確度驗(yàn)證通過，說明該測(cè)量程序能夠滿足臨床需求。目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道EP15-A3多用于臨床化學(xué)和免疫測(cè)量程序的性能驗(yàn)證[9-10]。本研究以HBV-DNA檢測(cè)為例，將EP15-A3應(yīng)用于臨床分子診斷定量檢測(cè)方法和程序的精密度和正確度驗(yàn)證，供同行參考。