仇泓博，樊曉盼，吳晨燕，任小青

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

我國處于亞熱帶和溫帶地區(qū)，氣溫適宜，有利于河蟹的生長繁殖，河蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界第一[1]。河蟹味道鮮美，營養(yǎng)價值高，包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、磷、鐵、VA、VB1、VB2、煙酸、蟹紅素、蟹黃素等，是一種優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)蛋白源[2]。蟹殼中含豐富的鈣、多糖、甲殼素，具有良好的抗氧化作用[3]。目前河蟹常被加工成醉蟹、蟹肉罐頭、蟹肉松、蟹油、蟹黃醬等[4-5]，但加工過程中個體較小或斷肢殘肢的低值河蟹無法得到有效的利用，直接丟棄，不僅造成蛋白資源的極大浪費(fèi)，而且對環(huán)境造成嚴(yán)重污染[6]。

酶解是加工低值河蟹的一種有效渠道。酶解可以使河蟹中不易被利用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)殡暮陀坞x氨基酸。食品加工過程中，原料中的蛋白質(zhì)等含氮化合物在酶的作用下降解，可以產(chǎn)生特征風(fēng)味物質(zhì)，改善不良風(fēng)味，更易被消費(fèi)者接受[7]。陳啟航等[8]利用木瓜蛋白酶對金槍魚蒸煮液進(jìn)行酶解，去除了腥味，制成一種魚香濃郁的天然調(diào)味品。Li[9]用風(fēng)味蛋白酶對羅非魚進(jìn)行酶解后，具有良好風(fēng)味而沒有任何異味。張永生等[10]采用復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶處理雞肉，得到一類口感醇厚，持續(xù)性好的雞肉香精。Suroukat[11]采用胃蛋白酶對雞頭骨蛋白進(jìn)行酶解，確定了最佳酶解條件，并檢測到酶解液中含有豐富的氨基酸，為肉味香料的制備提供了前體物質(zhì)。Wei等[12]用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解亞麻籽蛋白，得到的水解產(chǎn)物口感提升，苦味顯著降低。

因此，本試驗以低值河蟹為原料，對其先進(jìn)行高壓浸提，隨后對高壓浸提液進(jìn)行酶解，以水解度和氨基態(tài)氮為評價指標(biāo)，通過響應(yīng)面優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶單獨(dú)添加時的酶解條件，為進(jìn)一步研究多酶復(fù)配酶解技術(shù)提供參考，為工業(yè)化生產(chǎn)蟹味香料提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低值河蟹：可可溢香（江蘇）味業(yè)有限公司；風(fēng)味蛋白酶（酶活500 LAPU/g）：丹麥諾維信酶制劑有限公司；木瓜蛋白酶（酶活2×105U/g）：廣西龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、酚酞、甲醛（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004精密分析天平：上海精科儀器公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY有限公司；THZ-98AB型恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟹味香料制備

將洗凈的河蟹放入沸水中燙漂3 min至外殼變紅，取出瀝干后絞碎。稱取25 g絞碎的河蟹，按質(zhì)量比1∶4的比例添加100 g水，在壓力0.1 MPa、浸提溫度120℃條件下浸提2 h得到河蟹蛋白浸提液；冷卻后加入蛋白酶，恒溫?fù)u床上振蕩酶解；沸水浴加熱20 min使蛋白酶完全失活；過濾，得蟹味香料。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)風(fēng)味蛋白酶推薦使用條件即溫度40℃～60℃、添加量為底物質(zhì)量的0.01%～0.1%，木瓜蛋白酶推薦使用條件即溫度50℃左右、添加量為底物質(zhì)量的0.1%～0.3%，并結(jié)合實際需求控制反應(yīng)時間，以蛋白水解度為響應(yīng)值，采用軟件Design Expert 10.0設(shè)計三因素三水平試驗，分別對風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解時間、酶解溫度以及酶添加量進(jìn)行優(yōu)化。因素水平及編碼見表1和表2。

表1 風(fēng)味蛋白酶響應(yīng)面試驗因素及水平編碼值Table 1 Factor and levels in response surface methodology of flavourzyme

表2 木瓜蛋白酶響應(yīng)面試驗因素及水平編碼值Table 2 Factor and levels in response surface methodology of papain

1.3.3 氨基態(tài)氮含量及水解度測定

氨基態(tài)氮含量：參考GB/T 12143-2008《飲料通用分析方法》以及趙新淮等[13]甲醛電位滴定法。

式中：V1表示樣品加入甲醛后消耗NaOH溶液的體積，mL；V2表示空白對照組加入甲醛后消耗NaOH溶液的體積，mL；NNaOH表示NaOH溶液的濃度，mol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)味蛋白酶響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.1.1 回歸模型建立與顯著性檢驗

風(fēng)味蛋白酶響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。試驗后利用軟件Design-Expert 10.0對上述試驗結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸分析，可建立水解度（Y）對酶解時間（A）、酶解溫度（B）和酶添加量（C）的二次回歸方程：

對試驗所建立的回歸模型進(jìn)行方差分析結(jié)果見表4。P值=0.000 5＜0.01，達(dá)極顯著水平；失擬項P值=0.801 0＞0.05，不顯著，說明本試驗所建立的回歸模型擬合度較高，能夠真實的擬合響應(yīng)面。相關(guān)系數(shù)R2=0.957 3，說明采用響應(yīng)面法所建立的回歸模型回歸效果較好。此外，通過比較回歸方程中一次項系數(shù)絕對值的大小，可看出3個因素對風(fēng)味蛋白酶酶解效果的主次順序依次為：酶解溫度（B）＞酶添加量（C）＞酶解時間（A）。

表3 風(fēng)味蛋白酶響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Central composite design scheme and results for response surface analysis of flavourzyme

表4 風(fēng)味蛋白酶響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation of flavourzyme

續(xù)表4 風(fēng)味蛋白酶響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation of flavourzyme

2.1.2 響應(yīng)曲面和等高線圖分析

3D圖可以評價各因素間的交互作用，響應(yīng)面圖彎曲度越大，表明兩因素交互越顯著。等高線的形狀可以更為直觀的反應(yīng)兩變量的交互作用顯著與否，等高線為橢圓形，則表示兩變量交互作用顯著[14-15]。

酶解時間與酶解溫度對水解度的影響如圖1所示，響應(yīng)曲面彎曲度大，說明其兩兩之間的交互作用對水解度的影響是顯著，即在酶解時間1.8 h～2 h，酶解溫度45℃～47℃范圍內(nèi)，水解度處于最大值區(qū)域；酶解溫度與酶添加量對水解度的影響如圖2所示，即酶添加量0.08%～0.09%，酶解溫度45℃～47℃范圍內(nèi)，水解度處于最大值區(qū)域。從等高線橢圓曲線來看，酶解溫度和酶添加量存在更為顯著的交互作用，在酶添加量一定時，酶解溫度與水解度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，較低溫度時水解度隨酶添加量遞增有升高趨勢。酶解時間與酶添加量對水解度影響如圖3所示，酶解時間與酶添加量響應(yīng)曲面較平緩，等高線近似呈圓形，因此它們之間對水解度影響較低。

圖1 時間、溫度對DH影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and temperature on DH of crab extract

圖2 溫度、酶添加量對DH影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis temperatureand and flavourzyme amount on DH of crab extract

圖3 時間、酶添加量對DH影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and flavourzyme amount on DH of crab extract

2.2 木瓜蛋白酶響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 回歸模型建立與顯著性檢驗

木瓜蛋白酶響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果見表 5，以酶解時間（A）、酶解溫度（B）和酶添加量（C）為自變量，水解度（Y）為響應(yīng)值，對木瓜蛋白酶酶解試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，所建立的回歸方程為：

對試驗所建立的回歸模型進(jìn)行方差分析結(jié)果如表6所示，回歸模型回歸效果較好，能夠用于預(yù)測木瓜蛋白酶對河蟹高壓浸提液的酶解效果，3個因素對蛋白酶的酶解效果影響主次順序依次為酶添加量（C）＞酶解溫度（B）＞酶解時間（A）。

2.2.2 響應(yīng)曲面和等高線圖分析

木瓜蛋白酶酶解時間與酶解溫度對水解度的影響如圖4所示，酶解時間與酶解溫度響應(yīng)曲面彎度較大，表明時間與溫度對水解度影響顯著，在酶解時間一定時，隨溫度升高，水解度先升高后降低，在48℃～52℃之間達(dá)到最高值?？赡苁怯捎跍囟鹊陀?8℃，蛋白酶無法充分發(fā)揮功效，高于52℃，蛋白酶失活，也符合了所用木瓜蛋白酶最適溫度為50℃左右這一設(shè)計響應(yīng)面試驗的前提條件；酶解溫度與酶解時間對水解度的影響如圖5所示，酶解溫度與酶添加量響應(yīng)曲面彎度最大，等高曲線呈橢圓形，表明兩者間交互作用對水解度影響極為顯著；酶解時間與酶添加量對水解度影響如圖6所示，酶解時間與酶添加量響應(yīng)曲面平緩，兩者間交互作用對水解度影響較低，但在選定的范圍內(nèi)，水解度與酶解時間和酶添加量均呈正相關(guān)關(guān)系。

表5 木瓜蛋白酶響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Central composite design scheme and results for response surface analysis of papain

表6 木瓜蛋白酶響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis for the fitted regression equation of papain

2.3 驗證與優(yōu)化

分析回歸方程Y1，得到風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解條件為：酶解溫度47.657℃、酶解時間1.161 h、酶添加量0.084%，在此條件下預(yù)測水解度可達(dá)到10.697%，考慮到實際操作的可行性，將最佳工藝條件修整為酶解溫度為47℃、酶解時間1.2 h、酶添加量0.08%。重復(fù)試驗3次，測得水解度平均值11.08%；分析回歸方程Y2，得到木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為：酶解溫度52.991℃、酶解時間1.649 h、酶添加量0.059%，在此條件下預(yù)測水解度可達(dá)到10.269%，同理修整工藝條件為酶解溫度為53℃、酶解時間1.6h、酶添加量0.06%，水解度平均值10.64%，實際測定值與模型預(yù)測值基本一致，可見該模型能較好地預(yù)測實際河蟹高壓浸提液酶解過程中水解度的變化。

圖4 時間、溫度對DH影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and temperature on DH of crab extract

圖5 溫度、酶添加量對DH影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis temperature and papain amount on DH of crab extract

圖6 時間、酶添加量對DH影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and papain amount on DH of crab extract

3 結(jié)論

基于響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果，得到風(fēng)味蛋白酶最佳工藝條件為添加0.08%風(fēng)味蛋白酶，47℃下酶解1.2 h，水解度可達(dá)11.08%；木瓜蛋白酶最佳工藝條件為0.06%木瓜蛋白酶，53℃下酶解1.6 h，水解度為10.64%，得到的蟹味香料色澤金黃，河蟹特征風(fēng)味濃郁，無不良風(fēng)味，可作為一類新型蟹味香料進(jìn)行生產(chǎn)。下一步可將兩種酶結(jié)合復(fù)配使用，是否會得到更好的效果有待研究。