張秋霞，陳康，汪金玉，黃蕊，何慧

（廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州 510006）

橘葉為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的葉。橘在我國廣東、廣西、湖南等地區(qū)均有栽培。關(guān)于橘葉的應用，歷史悠久，在《本草綱目》、《本草匯言》、《本草從新》等醫(yī)書中都有橘葉作為藥用的記載，曰其具有疏肝、行氣、化痰、消腫之功效[1]?，F(xiàn)代“乳塊消片”等成藥中也應用了橘葉[2]。橘葉在食品中亦有應用，如橘葉茶、橘葉飲料等。

已有的研究資料表明，黃酮類化合物作為橘葉的主要化學成分，約占其化合物總類的64.5%[3-4]，其中黃酮類化合物在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等方面均表現(xiàn)了較優(yōu)異的應用價值[5-8]。前期研究人員已從提取、分離、鑒別、含測、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜等多方面對橘葉及其所富含的黃酮類成分進行了研究[9-13]，然未見關(guān)于橘葉黃酮純化工藝研究的相關(guān)報道，大孔樹脂作為一種具有多孔性、比表面積大的高分子吸附劑已廣泛應用于中藥黃酮類化合物的純化[14-16]。本試驗將對橘葉總黃酮的純化工藝及其純化前后抗氧化能力進行研究，以期為橘葉的綜合開發(fā)利用提供科學參考。

1 材料與試劑

1.1 材料與試劑

橘葉于2017年8月，分別采自廣東廣寧、廣東德慶、廣東四會、廣東懷集以及廣西都安五地。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥學院陳康教授鑒定，其基原植物為橘（Citrus reticulata Blanco），以上憑證標本存于廣州中醫(yī)藥大學中藥學院中藥炮制實驗室。

AB-8大孔樹脂（粒徑：0.3 mm～1.25mm；比表面積：480 m2/g～520m2/g）：南開大學；D-101大孔樹脂（粒徑：0.3 nm ～1.25 nm；比表面積：600 m2/g～700 m2/g）：南開大學；橙皮苷（純度＞98%；批號：150912）：四川省維克奇生物科技有限公司；1，1-二硝基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；氫氧化鈉：福晨化學試劑有限公司；硝酸鋁：廣州化學試劑廠；水楊酸：天津市大茂化學試劑廠；雙氧水：成都艾科達化學試劑有限公司；無水乙醇：天津大茂化學試劑廠；以上均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5500PC型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；BT125D分析天平（d=0.01 mg）：賽多利斯科學儀器北京有限公司；DZWK-S-5恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；PHS-3C pH計：上海盛磁儀器儀器有限公司；MULTISKAN GO酶標儀：Thermo Fisher Scientific OY；層析柱（直徑2 cm，長30 cm，1 BV=94 mL）：廣州市海珠區(qū)江南寶龍玻璃儀器廠；THZ-D恒溫振蕩器：蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的純化

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的橙皮苷對照品5.82 mg，置50 mL容量瓶中，用50%乙醇加至刻度，搖勻，得對照品溶液（0.114 6 mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液的制備

取采自德慶的橘葉50 g，切寬絲，置于圓底燒瓶中，以1∶10（g/mL）料液比加入50%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并兩次濾液，將濾液放在水浴鍋上揮至無醇味，加蒸餾水定容至500 mL，待測。

2.1.3 總黃酮含量測定

文中所涉及的所有總黃酮含量測定均采用文獻[9]建立的方法，即：取待測溶液適量，置25 mL量瓶中，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加10%NaOH溶液10 mL，加50%乙醇至刻度，放置15 min，即得，同時，以相應的溶劑制作空白樣品用于基線校正。

結(jié)果，以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=32.474C-0.043 6，r=0.999 2。以此回歸方程測算，2.1.2項下橘葉提取液中總黃酮含量為4.8 mg/mL。

2.1.4 大孔樹脂的預處理

將大孔樹脂用95%乙醇浸泡過夜，使其充分溶脹，傾去乙醇漂浮物后濕法裝柱，加95%乙醇洗脫至流出液放置于蒸發(fā)皿內(nèi)水浴蒸干無固體殘渣為止，用蒸餾水洗脫至無醇味，備用。

2.1.5 靜態(tài)吸附與解吸

分別稱取處理后的AB-8、D-101大孔樹脂3g（濕重），置250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL黃酮含量為4.8 mg/mL的橘葉提取液（上樣液），于25℃轉(zhuǎn)速140 r/min的恒溫振蕩器上振蕩吸附12 h，取出，抽濾，抽濾液保存待測總黃酮含量（吸附液）。樹脂用蒸餾水清洗后倒回錐形瓶中，加入50mL75%乙醇液，于25℃轉(zhuǎn)速140 r/min的恒溫振蕩器上振蕩解吸24 h，取出，抽濾液保存待測總黃酮含量（解吸液）。按如下公式，分別計算兩種樹脂的吸附量Q（mg/g）和解吸率J（%）。

式中：V為溶液體積，mL；C0為上樣液液濃度，mg/mL；C1為吸附液濃度，mg/mL；C2為解吸液濃度，mg/mL；M為樹脂質(zhì)量，g。

結(jié)果，D-101型大孔樹脂與AB-8型大孔樹脂吸附量分別為36.12 mg/g和39.43 mg/g，解吸率分別為98.05%和95.88%，差異均較小，最終選擇解吸率較高的D-101型大孔樹脂進行動態(tài)吸附。

2.1.6 動態(tài)吸附試驗

2.1.6.1 上樣液泄露曲線測試

稱取經(jīng)預處理的D-101大孔樹脂5.00 g進行動態(tài)吸附，以黃酮含量為4.8 mg/mL的橘葉提取液上樣，分段收集流出液，每份2 mL，收集80份，以上樣體積為橫坐標，以流出液黃酮濃度為縱坐標，繪制泄露曲線見圖1。當流出液中黃酮濃度達到上樣液濃度的10%時為泄露點，當流出液中黃酮濃度為上樣液濃度的100%時為飽和點。

結(jié)果如圖1，上樣液體積至第4個流份時，流出液中總黃酮質(zhì)量濃度為0.55 mg/mL，略超過茶枝柑供試品總黃酮質(zhì)量濃度的10%；綜合考慮，本試驗上樣液總黃酮量與樹脂質(zhì)量之比為7.7∶1（mg/g）。

圖1 泄露曲線Fig.1 Leakage curve

2.1.6.2 上樣液質(zhì)量濃度的選擇

稱取處理過的D-101大孔樹脂5.0 g（濕重），濕法上柱。將濃度分別為 1、2、3、4、4.8 mg/mL，pH 值為 5 的提取液各8 mL上柱，收集流出液，測定黃酮濃度，按式計算樹脂的吸附率Q1（%）

式中：C3為上樣液濃度，mg/mL；V3為上樣液體積，mL；C4為流出液濃度，mg/mL；V4為流出液體積，mL。

結(jié)果如圖2所示，在一定范圍內(nèi)吸附率隨著質(zhì)量濃度增加而增加；超過一定范圍時，吸附率隨著質(zhì)量濃度增加而下降。根據(jù)該結(jié)果選擇1、2、3 mg/mL作為因素上樣液濃度的3個水平值，開展進一步工藝優(yōu)化。

2.1.6.3 上樣液pH值的選擇

稱取處理過的D-101大孔樹脂5.0 g，濕法上柱。取2 mg/mL的樣品液，NaOH或HCl調(diào)pH值為2、3、4、5、6、7后上柱，收集流出液。測定黃酮質(zhì)量濃度，按式計算吸附率Q1（%）。上樣液pH值對吸附性能的影響見圖3。

圖2 質(zhì)量濃度對吸附性能的影響Fig.2 Effect of mass concentration on the adsorption properties

圖3 上樣液pH值對吸附性能的影響Fig.3 Effect of sample solution pH on adsorption performance

結(jié)果如圖3，pH值為3時吸附率最高，隨著pH值的進一步增大，吸附率呈下降趨勢，根據(jù)該結(jié)果選擇2、3、4作為因素pH值的3個水平值，開展進一步工藝優(yōu)化。

2.1.6.4 上樣液流速的選擇

精確稱取處理過的D-101大孔樹脂5.0 g，濕法上柱。取2 mg/mL的樣品液，調(diào)至pH值為3，分別以0.5、1、1.5、2、2.5 BV/h的流速流過樹脂柱，收集流出液。蒸餾水定容到適當體積，測定黃酮質(zhì)量濃度，按式計算吸附率Q1（%）。樣液流速對吸附性能的影響見圖4。

圖4 上樣液流速對吸附性能的影響Fig.4 Effect of sample flow rate on polyamide adsorption performance

結(jié)果如圖4，在不同的上樣流速下，吸附率均較高，差異較小，綜合考慮選擇0.5、1.0、1.5 BV/h作為因素上樣流速的3個水平值，開展進一步工藝優(yōu)化。

2.1.7 響應面法優(yōu)化吸附工藝

根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，綜合動態(tài)吸附單因素試驗結(jié)果，對上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH值、上樣流速3個因素進行試驗設(shè)計，因素與水平設(shè)計如表1所示。

表1 因素與水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels of response methodology

響應面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，利用Design-Expert軟件對表2的試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到二次多項式回歸模型：Y=98.23962+0.72285A-0.4149B-0.508 48C+0.050 05AB+0.330 8AC-0.084BC-0.322 06A2-0.229 66B2-0.068 21C2。方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應面設(shè)計結(jié)果Table 2 Response surface design results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

由表3可知所得回歸模型的P＜0.05，失擬項P＞0.05，說明試驗所選用的二次多項模型具有極顯著性且失擬項不顯著，模型具有較好的擬合性，可用于分析和預測。

從回歸方程模型因變量方差分析可知：模型的一次項A、B、C差異極顯著，交叉項AB、BC差異不顯著，二次項A2差異極顯著、B2差異顯著，說明所選因素與響應值之間不是簡單的線性關(guān)系。同時，由一次項F值的大小可以推斷，各因素在試驗范圍內(nèi)對吸附率的影響排序為：A（質(zhì)量濃度）＞C（上樣液流速）＞B（pH值）。流速、pH值、質(zhì)量濃度對總黃酮吸附率交互影響響應面圖見圖5。

圖5 流速、pH值、質(zhì)量濃度對總黃酮吸附率交互影響響應面圖Fig.5 Response surface plot showing the effect of adsorption rate of total flavonoids with flow rate，pH and mass concentration

圖5分析可以得出：3種因素交互作用較顯著，表現(xiàn)為曲線坡度較陡，對比A（質(zhì)量濃度）與B（pH值）、A（質(zhì)量濃度）與C（上樣液流速）、B（pH值）與C（上樣液流速）交互作用等高線圖密集度，與表3響順序相吻合，即A（質(zhì)量濃度）＞C（上樣液流速）＞B（pH值）。

2.1.8 動態(tài)解吸試驗

2.1.8.1 洗脫劑濃度考察結(jié)果

稱取D-101大孔樹脂5.0 g，濕法上柱，量取8 mL，pH值為3，質(zhì)量濃度為2 mg/mL的上樣液上樣，以1 BV/h的流速流過樹脂柱。吸附30 min后。用蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)。分別用相同體積25%、50%、75%、95%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，定容，測定吸光度，按2.1.3項下方法測定各洗脫液的吸光度，計算黃酮濃度。以不同濃度醇液為橫坐標，流出液中黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制曲線見圖6。

圖6 洗脫液濃度對解析率影響Fig.6 Influence of eluent concentration on resolution rate

結(jié)果如圖6，隨乙醇濃度的增加，洗脫液對橘葉的解析率逐漸增大。當乙醇濃度大于50%時，雖解析率稍有增加，但洗脫效果變化不大，考慮到試驗成本，決定用50%的乙醇進行洗脫。

2.1.8.2 洗脫劑用量考察

稱取D-101大孔樹脂5.0 g，量取8 mL，pH值為3，質(zhì)量濃度為2 mg/mL的上樣液上樣，以1 BV/h的流速流過樹脂柱。吸附30 min后，用蒸餾水除去水溶性雜質(zhì)。用50%乙醇洗脫，分段收集流出液，每份4 mL，收集9份，按2.1.3方法測定每份洗脫液的吸光度，計算黃酮質(zhì)量濃度。以洗脫體積為橫坐標，以黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制曲線見圖7。

圖7 洗脫劑用量對解析率影響Fig.7 Influence of eluent dosage on resolution rate

結(jié)果如圖7，當洗脫劑用量為28 mL時，流出液的總黃酮濃度基本不再發(fā)生變化，從成本方面考慮，確定洗脫劑用量與樹脂質(zhì)量之比為5.6∶1（mL/g）。

2.1.9 最佳工藝條件求取與工藝驗證

通過Design-Expert軟件對模型極值求解結(jié)合分析等高線得到最佳工藝：上樣液質(zhì)量濃度為2.37mg/mL，上樣液流速0.52 BV/h，上樣液pH值為2.34，預測最大吸附率為98.88%。綜合考慮單因素結(jié)果和實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為上樣液濃度2 mg/mL，上樣液流速1 BV/h，上樣液pH值為2.5；其他條件為上樣液總黃酮量：樹脂體積為 7.7∶1（mg/mL），洗脫劑用量與樹脂質(zhì)量之比為5.6∶（mL/mg）。

以修正后最佳工藝重復純化操作3次，以驗證工藝穩(wěn)定性。結(jié)果顯示經(jīng)純化后總黃酮含量從4.8%提升至72.8%。

2.2 體外抗氧化能力檢測

2.2.1 羥基自由基清除試驗

5批橘葉，按2.1.2項下制備純化前溶液，按2.1.9項下修正后最佳工藝條件純化制得純化后溶液。按照參考文獻[17]中的方法，所得的純化前和純化后溶液分別稀釋 1、1.25、2.5、5、10 倍，依法進行測定。

以總黃酮濃度統(tǒng)一將柱前柱后濃度換算至同一水平，計算清除率。結(jié)果如圖8所示，不同批次藥材純化后自由基清除率均高于純化前，說明經(jīng)純化富集得到的黃酮成分是總黃酮中發(fā)揮羥基自由基清除作用的主要貢獻成分。

圖8 純化前后羥自由基清除率Fig.8 Hydroxyl radical scavenging rate before and after purification

2.2.2 DPPH自由基清除試驗

取約25 mg DPPH，精密稱定，甲醇定容至50 mL，避光保存。將2.2.1項下提取液分別稀釋1、5、10、20、40、80、160倍。DPPH溶液與樣品溶液按照體積比1∶1加入96孔板。樣品組（Ai）：100 μL DPPH溶液+100 μL樣品溶液；對照組（Aj）：100 μL甲醇+100 μL樣品溶液；空白組（A0）：100 μL DPPH 溶液 +100 μL 蒸餾水。完成加入后避光顯色30 min，將96孔板放入酶標儀，于517 nm處測量吸光度。DPPH自由基清除率公式為：清除率/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100。

以總黃酮濃度統(tǒng)一將柱前柱后濃度換算至同一水平，計算清除率。結(jié)果如圖9所示，不同批次藥材純化后自由基清除率均高于純化前。說明經(jīng)純化富集得到的黃酮成分是總黃酮中發(fā)揮DPPH清除作用的主要貢獻成分。

圖9 純化前后DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH radical clearance rate before and after purification

3 討論與結(jié)論

大孔樹脂作為中藥提取物總黃酮分離純化方面常用的樹脂，具有價廉易得，重復使用等優(yōu)點，該試驗在此基礎(chǔ)上考察大孔樹脂分離純化橘葉總黃酮的工藝條件及其純化前后的抗氧化活性。通過考察上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH值、上樣液流速的單因素并應用響應面法考察兩因素間交互作用，研究吸附因素對D101樹脂純化橘葉總黃酮的影響，進而考察洗脫劑及其用量。最終篩選出較優(yōu)的總黃酮純化條件，該純化工藝操作簡便，參數(shù)穩(wěn)定。

為驗證純化分離效果，以羥自由基的清除活性、DPPH自由基的清除活性考察橘葉總黃酮純化前后的抗氧化活性。試驗結(jié)果表明，橘葉本身有一定的抗氧化活性，經(jīng)純化后，其抗氧化活性顯著增強，并呈現(xiàn)濃度依賴性，且不同產(chǎn)區(qū)樣品均呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢，該結(jié)果為純化工藝的可操作性提供了試驗依據(jù)。同時為橘葉總黃酮的進一步開發(fā)為化妝品、保健品及藥品等抗氧化劑提供理論基礎(chǔ)，促進橘葉資源的開發(fā)利用。