孫施杰，王 羽中，茅慧玲

（浙江農(nóng)林大學動物科技學院，浙江臨安 311300）

早期斷奶可促進羔羊瘤胃發(fā)育、滿足補償性生長以及提高母羊的繁殖率等[1-2]。然而早期斷奶時羔羊易出現(xiàn)“應激綜合征”，尤其是胃腸道的氧化應激會使羔羊出現(xiàn)“生長性休克”或負增長，導致成活率和育成率降低。亮氨酸作為動物的必需氨基酸，除參與哺乳動物蛋白質(zhì)合成和骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)、腸道發(fā)育調(diào)節(jié)外[3-5]，還是一種有效的抗氧化物質(zhì)，可以有效緩解氧化應激，維持機體抗氧化系統(tǒng)的平衡[6]。胡軍等[7]研究報道，添加亮氨酸可以降低早期斷奶仔豬腸道的活性氧水平。因此推測，新生羔羊補飼亮氨酸可促進瘤胃的早期發(fā)育，促進瘤胃微生物區(qū)系的建立，減緩早期斷奶應激引起的氧化損傷，從而提高生產(chǎn)性能。本研究利用高通量測序技術(shù)探討亮氨酸對早期斷奶湖羊羔羊瘤胃細菌菌群組成以及瘤胃發(fā)酵的影響，從瘤胃微生物角度研究亮氨酸對瘤胃發(fā)育影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 選取出生5 d 健康無疾病的湖羊羔羊36只，根據(jù)體重、出生日期相同或相近的原則，按照亮氨酸的添加量不同隨機分為對照組（C，0 g/d）、低劑量添加組（L，0.66 g/d）和高劑量添加組（H，1.33 g/d），每組4 個重復，每個重復3 只羔羊。羔羊飼喂代乳粉，每天飼喂3 次，自由采食；經(jīng)5 d 適應環(huán)境和代乳粉后，于10 日齡開始正式試驗，飼喂代乳粉的同時補喂開食料及羊草。代乳粉的飼喂量為每天780 mL/ 只（根據(jù)適應期代乳粉的采食量確定），為促進開食料和羊草的采食，代乳粉每天減少30 mL/ 只至210 mL/ 只時，維持此飼喂量不變直至30 日齡斷奶。亮氨酸溶解在70 mL代乳粉中，于每天晨飼時通過灌喂的方式添加1次。

羔羊在30 日齡斷奶當天，根據(jù)平均體重和平均日采食量每個重復取1 只羔羊進行屠宰。在瘤胃顱腹囊的中心采集1 m3左右的瘤胃組織樣品，保存在30% 的福爾馬林溶液中。瘤胃內(nèi)容物部分保存于-20 ，用于測定瘤胃發(fā)酵參數(shù)，另一部分保存于-80 ，用于提取DNA，測定瘤胃細菌的多樣性。

表1 代乳粉、開食料及羊草營養(yǎng)成分① %

1.2 試驗日糧 試驗日糧由代乳粉、開食料（杭州思我特農(nóng)業(yè)科技有限公司）和羊草組成，其營養(yǎng)成分見表1。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 瘤胃組織形態(tài) 瘤胃組織樣品采用酒精脫水（50%、70%、80%、95%、100% 酒精脫水30 min，100% 酒精脫水15 min），脫水后組織轉(zhuǎn)移至二甲苯透明2 h 后石蠟包埋，切成5 μm 厚的切片，進行蘇木精-伊紅染色法。光學顯微鏡（Leica，美國）下的每張切片隨機選10 個典型視野，使用Motic Image Plus 2.0 軟件（廈門，中國）測定瘤胃乳頭長度和寬度。

1.3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù) 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）：采用氣相色譜法測定瘤胃內(nèi)容物VFA 濃度。取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無菌PBS 中震蕩懸浮洗滌，13 000×g 4 離心15 min，取上清液，每1 mL VFA 樣品中加入20 μL 85%～90% 正磷酸，按照上述方法再次離心，取上清液，采用氣相色譜（GC-8A；島津公司，京都，日本）測定乙酸、丙酸和丁酸的濃度，進樣量為2 μL，注射器/ 檢測器的溫度為260 ，柱溫為220 ，載氣為高純氮[8]。

氨態(tài)氮（NH3-N）濃度：取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無菌PBS 中震蕩懸浮洗滌，取5 mL 于3 500～4 000 r/min 離心10 min，取上清，采用馮宗慈等[9]方法，使用氯化銨作為標準品，用酶標儀測定700 nm 波長條件下上清中NH3-N 濃度。

微生物蛋白：取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無菌PBS中震蕩懸浮洗滌，取8 mL，4 20 000×g 離心20 min，去上清。采用嘌呤法，以酵母RNA 作為標準品，使用紫外分光光度計（Beckman，DU 640）測定在260 nm波長條件下微生物蛋白含量。

1.3.3 瘤胃細菌多樣性

1.3.3.1 DNA 提 取 參 照 Gagen 等[10]的 珠 磨 法 提 取DNA。所有DNA樣品用Qubit2.0（Invitrogen）測定濃度。

1.3.3.2 細菌16S rRNA 基因序列擴增 16S rRNA 基因序列擴增采用341F/806R 通用引物[11]：上游為5'-ACTCCTA CGGGRSGCAGCAG-3'；下游為 5'-GGACTACVVGGGTA TCTAATC-3'。為區(qū)分每個不同的樣本，在通用引物的上游序列中隨機添加8 個核苷酸堿基的序列標簽，即Barcoded-tag，形成Barcoded 融合引物。PCR 反應條件：95 預變性 5 min；95 變性 40 s，55 退火 40 s，72 延伸 1 min，共 30 循環(huán)；72 延伸 7 min。

1.3.3.3 Illumina HiSeq 測序及下機數(shù)據(jù)分析 Illumina-HiSeq 測序及數(shù)據(jù)分析委托上海銳翌生物科技有限公司完成。測序后首先對原始數(shù)據(jù)拼接（PANDAseq 軟件）和質(zhì)控（去除平均質(zhì)量低于20 的reads，去除reads含N 堿基數(shù)超過3 個的reads）得到Clean reads；采用Usearch軟件在97% 相似度下進行聚類以及嵌合體過濾從而得到OTU；對每個樣品的Reads 進行隨機抽平處理，并提取對應的OTU 序列；采用Qiime 軟件做Alpha 多樣性指數(shù)的稀釋曲線，根據(jù)稀釋曲線選擇合理的抽平參數(shù)；從Qiime 軟件分析抽平后的OTU 中分別提取1條Read 作為代表序列，使用RDP 方法，將該代表序列與16S 數(shù)據(jù)庫比對，對每個OTU 進行物種分類；歸類后，根據(jù)每個OTU 中序列的條數(shù)，得到OTU 豐度表，最后根據(jù)該OTU 豐度表進行后續(xù)分析。微生物各門屬和OTU 需在每個處理組的至少3 只羔羊中出現(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計分析 用SAS 8.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，正交多項式比較不同水平亮氨酸的作用（線性或二次），差異顯著時用Duncan's 作多重比較。以P≤0.01 表示為差異極顯著，P≤0.05 表示為差異顯著，以 0.05＜P≤0.10 表示差異有趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加亮氨酸對羔羊瘤胃組織形態(tài)的影響 由圖1 可見，日糧添加亮氨酸可以增加羔羊瘤胃乳頭的長度。由表2 可見，瘤胃乳頭長度隨著亮氨酸添加量的增加而增加，且在C 組與H 組達顯著水平（線性，P＜0.01）；添加亮氨酸可使瘤胃乳頭寬度有增加趨勢，但3 組間無顯著差異（線性，P＞0.05）。

2.2 添加亮氨酸對羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表2 可見，亮氨酸可使瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）水平顯著提高（二次，P=0.05），但未改變乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比例（P＞0.05）。與C 組相比，L 與H 組的瘤胃NH3-N 濃度均顯著降低（線性，P＜0.05；二次，P＞0.05）， 分別降低 43.0% 和 36.7%， 且 L 組羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物蛋白濃度顯著高于C 組（二次，P=0.05）。

2.3 添加亮氨酸對羔羊瘤胃微生物多樣性的影響

表2 添加亮氨酸對羔羊瘤胃組織發(fā)育及發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3.1 微生物多樣性分析 下機序列經(jīng)拼接、優(yōu)化、質(zhì)控后共得到566 213 條優(yōu)質(zhì)序列，平均每個樣品47 184條（±4 391 條）。共獲得343 個OTU，平均每個樣品148 個（±22 個）。樣品稀釋曲線如圖2 所示，Good's coverage 在0.99 以上，因此，本試驗測序深度能夠準確反映湖羊瘤胃微生物組成。

由表3 可見，3 組羔羊瘤胃內(nèi)容物的OTU 個數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。

由圖 3 可見，3 組 OTU 數(shù)共有 164 個，C、L 和H組特有的OTU 數(shù)分別為24、29、43 個。

2.3.2 添加亮氨酸對羔羊瘤胃物種分類的影響 瘤胃細菌門分類圖顯示（圖4），瘤胃內(nèi)細菌主要歸于厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria） 和變形菌門（Proteobacteria）四大類。3 個處理組瘤胃內(nèi)微生物種類存在差異（表4），L 組瘤胃內(nèi)最多的是厚壁菌門（49.5%），H 組擬桿菌門（51.4%）顯著高于L、C 組（二次，P=0.05）。

表3 97%相似性水平下物種豐富度和多樣性指數(shù)

表4 羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物門水平（＞0.1%）相對豐度

由表5 可知，各組均以普雷沃氏菌屬、歐陸森氏菌屬、小桿菌屬和瘤胃球菌屬為優(yōu)勢菌屬，且普雷沃氏菌占比例最多。H 組的普雷沃氏菌屬最多，達41.4%；與C 組相比，L 組的雙歧桿菌屬（ 二次，P＜0.05）、光崗菌屬（二次，P＜0.05）和巨型球菌屬顯著增加（二次，P＜0.01）；梭菌屬隨著亮氨酸的添加而降低，且在C 組與H 組達顯著水平（線性，P＜0.05）。各組間歐陸森氏菌屬、擬桿菌屬、纖維桿菌屬、小桿菌屬、瘤胃球菌屬、琥珀酸菌屬等相對含量無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

瘤胃上皮約有25 萬個瘤胃乳頭，可使黏膜表面積擴大6～7 倍，從而通過增加瘤胃上皮與瘤胃內(nèi)容物的接觸面積來增加瘤胃上皮對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和離子轉(zhuǎn)運[12]。因此可通過瘤胃乳頭的發(fā)育狀況（長度和寬度）來衡量瘤胃發(fā)育狀況[13]，而瘤胃微生物發(fā)酵固體飼料產(chǎn)生的VFA 是刺激瘤胃乳頭發(fā)育的主要原因[14]。本研究顯示，添加亮氨酸雖然對乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比沒有影響，但可顯著增加TVFA 濃度，這部分結(jié)果與添加亮氨酸增加瘤胃乳頭長度的結(jié)果較為一致。亮氨酸增加TVFA 的主要原因與開食料采食量（123 g/d vs131 g/d vs 95.2 g/d，未發(fā)表數(shù)據(jù)）的變化有關(guān)。另一方面，L組羔羊消化道和瘤胃的重量與C 組相比分別提高47.4%和38.6%（未發(fā)表數(shù)據(jù)），表明添加適量亮氨酸可促進羔羊消化道和瘤胃的發(fā)育，有利于營養(yǎng)吸收。

表5 羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物屬水平（＞ 0.1%）相對豐度

瘤胃液中的NH3-N 是瘤胃氮代謝過程中內(nèi)源含氮物質(zhì)和外源蛋白質(zhì)降解的重要產(chǎn)物，同時也是瘤胃微生物合成微生物蛋白的主要原料。一般情況下，瘤胃NH3-N 水平呈現(xiàn)一個動態(tài)平衡狀態(tài)，但影響瘤胃NH3-N濃度的因素較多，主要包括飼料蛋白的降解程度、氮的攝入量、瘤胃對NH3-N 的吸收以及瘤胃微生物合成微生物蛋白的速度。本研究發(fā)現(xiàn)，添加亮氨酸可以降低瘤胃NH3-N 濃度，增加瘤胃微生物蛋白含量。推測可能的原因是亮氨酸作為一種氨基酸可以促進瘤胃內(nèi)蛋白分解菌的生長，從而提高瘤胃細菌對含氮物質(zhì)的降解，提高菌體蛋白合成的底物水平，最終增加瘤胃微生物蛋白的含量。后續(xù)可通過測定瘤胃蛋白分解菌的變化驗證這一推論。

腸道菌群主要由厚壁菌門（35%～80%）和擬桿菌門（17%～60%）構(gòu)成[15]。本試驗中厚壁菌門和擬桿菌門是各組羔羊瘤胃細菌豐度最高的菌群，與前人的研究結(jié)果較為一致。普雷沃氏菌屬是瘤胃內(nèi)容物中豐度最高的菌屬[16]，該菌屬是含有豐富高效的水解淀粉和蛋白質(zhì)的菌種[17]。雙歧桿菌屬是糖類分解菌[18]，尤其在飼喂高淀粉日糧的瘤胃中大量存在。因此，普雷沃氏菌屬和雙歧桿菌屬相對豐度變化受采食量的影響較大，然而L組普雷沃氏菌屬豐度較H 組顯著降低，這一結(jié)果與固體開食料采食量呈相反趨勢，說明在本試驗中亮氨酸對普雷沃氏菌屬豐度的影響并非取決于飼料的攝入量，具體的作用機理有待進一步研究。巨型球菌屬中的埃氏巨型球菌是瘤胃中提供支鏈VFA 的重要來源[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，在新生奶牛日糧中補飼埃氏巨型球菌NCIMB41125 能夠提高犢牛的生長性能，增加瘤胃內(nèi)丁酸濃度、瘤胃上皮乳頭寬度和密度，表明埃氏巨型球菌NCIMB41125 能通過促進瘤胃代謝、增加代謝產(chǎn)物的吸收來促進瘤胃的發(fā)育[20]。因此，瘤胃埃氏球菌屬相對豐度的增加在瘤胃發(fā)育中可能起重要作用。光崗菌屬具有很強的發(fā)酵碳水化合物的能力[21]，其終產(chǎn)物是乙酸和琥珀酸。添加低劑量的亮氨酸可以增加該菌屬的豐度，但是高劑量反而沒有顯著影響，原因還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗中，灌喂亮氨酸對早期斷奶羔羊的瘤胃細菌豐富度和多樣性沒有影響，但可以改變細菌組成（如瘤胃埃氏球菌屬和光崗菌屬的相對豐度增加），從而影響瘤胃發(fā)酵，增加羔羊瘤胃TVFA 含量，降低NH3-N 濃度，提高微生物蛋白濃度，促進瘤胃的發(fā)育，減少斷奶應激，且亮氨酸添加量以0.66 g/d 效果更為顯著。