耿曉林，周迎鋒，賈金領(lǐng)，馬超，徐海斌

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 骨外科一病區(qū)，河南 衛(wèi)輝 453100）

骨肉瘤是多見于20歲以下的青少年和兒童惡性骨腫瘤，占小兒腫瘤發(fā)病率的5%左右。骨肉瘤進展迅速，早期行腫瘤切除治療是改善治療結(jié)局、延長患者生存時間的最佳方法[1-2]。隨著外科技術(shù)的進展，骨肉瘤保肢術(shù)成為目前早期骨肉瘤患者的主要治療方式，該術(shù)式對患者的肢體功能及生活質(zhì)量均具有極大提高作用，但是較多學(xué)者對于其腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率方面的憂慮一直存在。如何最大程度殺滅惡性腫瘤細(xì)胞活性，增加保肢手術(shù)成功率是目前臨床研究的重點。新輔助化療是指實施局部治療前做的全身化療，其目的為縮小腫瘤、早期殺滅局部轉(zhuǎn)移灶，為后續(xù)手術(shù)及放化療奠定基礎(chǔ)[3-4]。目前關(guān)于新輔助化療在骨肉瘤手術(shù)中的應(yīng)用效果研究仍較少，本研究初步闡述新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)對骨肉瘤患者疾病惡性程度及遠(yuǎn)期預(yù)后的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2002年7月—2010年1月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的骨肉瘤患者78例作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)確診為骨肉瘤；②未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；③凝血功能正常；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性骨肉瘤；②伴嚴(yán)重心肝腎功能不全；③入院前3個月外科手術(shù)史；④伴自身免疫性疾病；⑤中途中斷新輔助化療；⑥患者本人或者家屬自愿放棄治療。

按照隨機數(shù)字表法將入組患者分為對照組和觀察組，每組39例。對照組：男性20例，女性19例；年齡9～41歲，平均（17.38±6.19）歲；股骨遠(yuǎn)端17例、脛骨近端12例、肱骨近端5例、其他5例。觀察組：男性21例，女性18例；年齡6～38歲，平均（18.19±6.55）歲；股骨遠(yuǎn)端15例、脛骨近端13例、肱骨近端6例、其他5例。兩組患者基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會成員討論并批準(zhǔn)。

1.2 治療方法

對照組患者接受保肢手術(shù)治療，具體如下：①腫瘤骨段切除。明確腫瘤切除的確切范圍，以核磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）及骨掃描結(jié)果為準(zhǔn)，距離腫瘤邊緣3～5 cm處完整切除腫瘤病灶，對毗鄰的血管神經(jīng)束應(yīng)一同切除。術(shù)后對瘤段標(biāo)本邊緣進行病理評估，若不到安全邊緣則再次切除骨骺。②移植骨段處理。術(shù)前30 min從骨庫中取出相應(yīng)骨段，室溫下復(fù)溫并用75%酒精沖洗，剔除多余軟組織。安裝髓內(nèi)固定裝置后用酒精沖洗肉眼可見松質(zhì)骨部位，用3%過氧化氫沖洗髓腔、松質(zhì)骨，最后用抗生素溶液沖洗。③骨重建。采用逆行髓內(nèi)釘固定移植的大段同種異體骨，適當(dāng)擴大骨髓腔。骨骺采用松質(zhì)骨拉力螺釘與截骨面垂體固定，在異體骨與自體骨界河部植入自體松質(zhì)骨粒。術(shù)后石膏固定肢體功能位6周，逐步開展功能鍛煉。

觀察組患者在保肢手術(shù)治療同時，加入新輔助化療，以4周為1個化療周期，術(shù)前進行2周期化療，術(shù)后繼續(xù)化療4～6周期，具體如下：甲氨蝶呤（悅康藥業(yè)集團有限公司，國藥準(zhǔn)字H20113120）10 g/m2，靜脈滴注，4～6 h，持續(xù)7 d；四氫葉酸（武漢世宏科貿(mào)有限責(zé)任公司）15 mg/m2，靜脈滴注，間隔6 h使用1次，持續(xù)3 d；第3周開始予以異環(huán)磷酰胺（海南錦瑞制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20113420）2 g/m2，靜脈滴注，持續(xù)5 d；阿霉素（廣東嶺南制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 H20063155）30 mg/m2，靜脈滴注，持續(xù) 3 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 組織 microRNA 表達 術(shù)中留取腫瘤組織標(biāo)本，采用RT-PCR法檢測目標(biāo)基因表達。根據(jù)microRNA Isolation Kit說明書提取總 RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Sigma公司）合成cDNA，采用Taq Man microRNA Assay Kit檢測樣本中 microRNA-145、microRNA-101、microRNA-335、microRNA-365表達。反應(yīng)條件 ：95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 15 s，60℃延伸 60 s，70℃退火 1 s，共計 40 個循環(huán)。反應(yīng)后得到基本循環(huán)數(shù)（Ct值）并根據(jù)公式計算目的基因表達量，設(shè)置對照組患者的上述基因microRNA表達量為100，計算觀察組患者的相應(yīng)基因microRNA表達量。

1.3.2 血清腫瘤標(biāo)志物 術(shù)后 4 周，抽取兩組患者的空腹、外周靜脈血2 ml，室溫靜置后4℃下低速離心取上清液，采用全自動生化分析儀（南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司）測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）含量。

1.3.3 遠(yuǎn)期預(yù)后 術(shù)后對兩組患者進行長期隨訪，記錄無進展生存時間（progression free survival time,PFS）、總生存時間（overall survival,OS）及 5 年生存率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，繪制生存曲線，采用Log-rank法比較兩組5年生存率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織microRNA表達比較

觀察組患者的術(shù)中腫瘤標(biāo)本組織中microRNA-145、microRNA-101、microRNA-335、microRNA-365表達與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組高于對照組患者。見表1。

2.2 血清腫瘤標(biāo)志物比較

術(shù)后4周，觀察組患者血清中腫瘤標(biāo)志物ALP、LDH、VEGF、bFGF的含量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組低于對照組患者。見表2。

表1 術(shù)中腫瘤組織microRNA表達量比較 （n=39，±s）

表1 術(shù)中腫瘤組織microRNA表達量比較 （n=39，±s）

組別 microRNA-145 microRNA-101 microRNA-335 microRNA-365觀察組 172.81±20.95 154.36±18.74 159.37±17.88 164.38±17.95對照組 100.00±10.72 100.00±11.63 100.00±10.74 100.00±11.62 t值 7.283 6.182 6.094 7.172 P值 0.011 0.023 0.027 0.015

表2 治療后血清腫瘤標(biāo)志物含量比較 （n=39，±s）

表2 治療后血清腫瘤標(biāo)志物含量比較 （n=39，±s）

組別 ALP/（IU/L） LDH/（IU/L） VEGF/（pg/ml） bFGF/（pg/ml）觀察組 73.27±8.12 89.26±9.12 283.91±30.18 163.29±20.85對照組 124.08±14.53 134.59±16.82 494.72±50.85 351.74±40.86 t值 7.293 8.192 11.273 13.872 P值 0.018 0.012 0.000 0.000

2.3 遠(yuǎn)期預(yù)后比較

隨訪期間，觀察組患者的PFS、OS時間分別為與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組時間長于對照組。生存曲線見附圖所示，觀察組患者的5年生存率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.265，P=0.004），觀察組高于對照組。見表3。

表3 兩組患者的治療后遠(yuǎn)期預(yù)后比較（n=39，年，±s）

表3 兩組患者的治療后遠(yuǎn)期預(yù)后比較（n=39，年，±s）

組別 PFS OS觀察組 3.42±0.45 6.23±0.71對照組 2.06±0.23 4.51±0.58 t值 5.283 6.091 P值 0.027 0.021

附圖 兩組患者的生存曲線

3 討論

新輔助化療是目前臨床應(yīng)用較多的早期腫瘤手術(shù)切除前化療方案，旨在增加手術(shù)腫瘤切除徹底性、減少術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率[5]。目前新輔助化療在胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤性疾病中已經(jīng)獲得成功應(yīng)用[6]。早期骨肉瘤患者以手術(shù)切除骨腫瘤組織為主要方法，骨肉瘤病灶邊緣無法有效切除時多采取截肢治療，故目前有學(xué)者提出將新輔助化療加入骨肉瘤手術(shù)治療中，以期提高患者的保肢手術(shù)成功率。

有研究認(rèn)為，新輔助化療是保肢手術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究根據(jù)骨肉瘤特性選擇甲氨蝶呤、四氫葉酸、異環(huán)磷酰胺、阿霉素等敏感性藥物組成化療方案，完成術(shù)前2個周期化療，對照組患者術(shù)前未作特殊處理，術(shù)中留取兩組患者的腫瘤組織標(biāo)本并檢測相關(guān)惡性分子表達量。近年研究發(fā)現(xiàn)，microRNA通過與靶mRNA 3'-端互補結(jié)合，實現(xiàn)對靶基因的表達調(diào)控作用，直接參與細(xì)胞的增殖分化、凋亡過程[7-8]。microRNA-145在較多研究中被發(fā)現(xiàn)可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、促進其凋亡；microRNA-101被發(fā)現(xiàn)低表達于骨肉瘤MG-63細(xì)胞中，與腫瘤增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)[9]。王勇等[10]研究指出，microRNA-335可通過靶向Spl基因抑制骨腫瘤細(xì)胞增殖；高金鑒等[11]研究明確，microRNA-365可以抑制骨肉瘤SOSP9607細(xì)胞增殖，通過調(diào)節(jié)KRAS發(fā)揮抑癌作用。本研究對腫瘤組織中的上述microRNA表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組患者比較，觀察組患者的術(shù)中腫瘤組織microRNA-145、microRNA-101、microRNA-335、microRNA-365表達均較高，說明新輔助化療可以有效激活抑癌基因的表達，積極殺滅骨肉瘤微小轉(zhuǎn)移灶及腫瘤細(xì)胞活性，為手術(shù)中腫瘤組織的完整切除奠定基礎(chǔ)。

新輔助化療貫穿圍術(shù)期，本次研究觀察組患者術(shù)后繼續(xù)接受4～6個周期的化療。血清骨肉瘤惡性程度相關(guān)指標(biāo)的表達量變化可以實時反映腫瘤進展情況，也是手術(shù)治療效果的間接衡量手段。ALP是公認(rèn)與骨肉瘤發(fā)生密切相關(guān)的因子，當(dāng)組織癌變發(fā)生時ALP大量分泌，其含量也可以很好地反映骨腫瘤治療預(yù)后[12-13]。LDH是機體糖酵解的限速酶，可以反映腫瘤組織代謝速率，國內(nèi)外較多文獻均報道，惡性腫瘤組織中存在LDH及其同工酶含量的上升。VEGF、bFGF均參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，VEGF具有強大的促血管生成作用，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)高表達于絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中；bFGF屬于血管生成正性調(diào)控因子，對腫瘤細(xì)胞生長及血管形成均具有促進作用[14-15]。術(shù)后4周，本研究對上述腫瘤相關(guān)因子含量進行檢測并發(fā)現(xiàn)，于對照組患者比較，觀察組患者的血清ALP、LDH、VEGF、bFGF含量均較低，提示術(shù)前新輔助化療可以有效降低骨肉瘤患者的術(shù)后腫瘤惡性程度，證實聯(lián)合治療在優(yōu)化近期療效方面的卓越效果。

以往骨肉瘤保肢手術(shù)患者的5年生存率并不高，這也成為保肢治療在臨床無法普及、患者術(shù)后生存質(zhì)量嚴(yán)重降低的主要原因之一[16]。本研究在術(shù)后對兩組患者進行長期隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：觀察組患者的PFS時間長于對照組，整體生存率高于對照組患者，也進一步證實了新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)在優(yōu)化骨肉瘤患者遠(yuǎn)期預(yù)后方面的肯定作用。

綜上所述，得出以下結(jié)論：新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)可抑制骨肉瘤組織惡性分子表達、增強手術(shù)治療效果，優(yōu)化遠(yuǎn)期治療結(jié)局