李珍，宋玉蘭，傅橋妹，曾超

（1.廣東醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)系，廣東 東莞 523808；2.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，廣東 廣州 510006）

宮頸癌是最常見女性惡性腫瘤之一，約83%病例發(fā)生于發(fā)展中國家，宮頸癌確診為早期的5年生存率為90%，晚期伴侵襲轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者預(yù)后較差，Ⅳ期患者5年生存率＜20%，盡管外科手術(shù)、放化療等治療方式日趨完善，但復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是宮頸癌治療失敗的主要原因[1-2]。宮頸癌發(fā)病相關(guān)分子較為繁多且復(fù)雜，因此，探索與發(fā)病相關(guān)的新的分子標(biāo)志物對于宮頸癌的預(yù)防及靶向治療尤為重要。

CD36又稱為GP88、GPⅢb，是一種蛋白分子量為88 kD的多功能跨膜糖蛋白受體，染色體定位7q11.2，最初發(fā)現(xiàn)于單核細(xì)胞及血小板，亦可表達(dá)于包括巨噬細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）等多種類型的血細(xì)胞，可作為長鏈脂肪酸受體、氧化低密度脂蛋白（OxLDLs）受體、血小板1（TSP1）受體、Ⅰ型膠原受體及內(nèi)皮細(xì)胞受體[3-4]參與機(jī)體生理或病理狀態(tài)下的不同生物學(xué)功能，包括血管生成、動(dòng)脈粥樣硬化、吞噬作用、炎癥、脂質(zhì)代謝及凋亡細(xì)胞的去除[5]。目前為止，CD36與宮頸癌的關(guān)系尚未見報(bào)道，因此，本研究旨在探討CD36在宮頸癌中的表達(dá)，分析其表達(dá)與宮頸癌臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月—2016年12月廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院宮頸癌患者102例。年齡25～76歲，中位年齡47歲；按病理分化程度：高分化29例，中分化37例，低分化36例；臨床TNM分期：Ⅰ期67例，Ⅱ、Ⅳ期35例；T分期：T1期75例，T2～T4期27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例；所有病例均無遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，臨床資料完整，病理診斷明確，術(shù)前均未接受放化療，且無其他基礎(chǔ)性疾病或急慢性病。同時(shí)選取46例癌旁正常組織為對照。

1.2 試劑與方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測 一抗（鼠抗人單克隆抗體，1∶50）購于美國Santa Cruz公司，免疫組織化學(xué)試劑盒（含二抗，羊抗鼠，即用型）、DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)公司，改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液購于碧云天生物技術(shù)公司。操作嚴(yán)格遵守試劑盒說明書操作規(guī)程，采用已知陽性組織作為陽性對照，PBS代替一抗作作陰性對照。具體操作步驟如下：烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，抗原修復(fù)液高壓修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷15 min，動(dòng)物非免疫血清室溫封閉1 h，滴加一抗4℃過夜，37℃孵生物素標(biāo)記的二抗1 h，之后滴加鏈酶抗生物素蛋白-過氧化物酶，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，水沖返藍(lán)，1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.2 蛋白提取及 Western blotting 篩選 一抗（鼠抗人單克隆抗體，1∶50）購于美國Santa Cruz公司，內(nèi)參（兔抗GAPDH多克隆抗體，1∶1 000）購于杭州賢至生物科技有限公司，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔，1∶1 000）、RIPA、PMSF、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購于上海碧云天生物科學(xué)技術(shù)有限公司，蛋白磷酸酶抑制劑混合物購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。3株宮頸癌細(xì)胞株（Hela、HCE1、C33a）細(xì)胞均來源于本課題組所在實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫冷凍保存細(xì)胞。具體操作步驟：取細(xì)胞培養(yǎng)箱中呈對數(shù)生長期細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗3次，加入現(xiàn)配裂解液（RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑為100∶1∶1），冰上迅速刮取蛋白，將混合液移至新的EP管，冰浴30 min，4℃12 000 r/min 離心 30 min，取上清液，蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液100℃ 變性，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，1×TBST配置5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜5 min×4次，二抗室溫孵育1 h，1×TBST洗膜5 min×4次，ECL 顯影，結(jié)果采用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。

1.3 結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果均至少由2位病理診斷醫(yī)生進(jìn)行雙盲判定，判定標(biāo)準(zhǔn)：包膜或胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒物質(zhì)可視為陽性，依據(jù)陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評分：無著色0分，淡黃染色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；每個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值作為陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)百分比計(jì)分：＜5%為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分；再將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞率計(jì)分作乘積分級：＞3分為弱陽性（+），6～9分為中陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++），凡（+）或（+）以上者均為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細(xì)胞株中CD36蛋白表達(dá)水平

3株宮頸癌細(xì)胞株（C33a、HCE1、Hela）中CD36/GAPDH蛋白灰度比值分別為（4.6±1.3）、（43.3±2.6）、（45.8±3.4）%，比較 C33a細(xì)胞，CD36在 Hela、HCE1細(xì)胞中呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.724和 22.054，P=0.002 和 0.002）。見圖1。

圖1 CD36在宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2 CD36在宮頸癌組織中的表達(dá)

CD36蛋白陽性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于胞質(zhì)或胞膜，免疫染色呈淡黃、棕黃或棕褐色（見圖2、3）。宮頸癌組織中CD36陽性表達(dá)率為72.5%（74/102），癌旁正常組織中CD36陽性表達(dá)率為21.7%（10/46），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=33.347，P=0.000）（見表1）。同時(shí)分析CD36在宮頸癌組織的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CD36在不同年齡、臨床分期及T分期的宮頸癌患者之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與腫瘤病理分化程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)聯(lián)，在高、中、低分化癌組織中CD36表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

圖2 CD36在宮頸癌組織中的表達(dá) （SP×400）

圖3 CD36在宮頸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)（SP×400）

表1 CD36在宮頸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

表2 CD36表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 例（%）

3 討論

研究表明，CD36作為一類多功能蛋白，通過結(jié)合不同配體除參與多種正常及異常生物學(xué)效應(yīng)外，還參與腫瘤形成的正反向調(diào)控過程。CD36作為血小板1（TSP-1）受體，可與TSP-1緊密結(jié)合并相互作用抑制腫瘤血管形成[6]，可能對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起負(fù)調(diào)控作用。然而，多數(shù)研究表明，在多種腫瘤進(jìn)展過程中CD36主要作為促癌基因參與腫瘤的調(diào)控。HALE等[7]研究顯示，CD36可作為惡性腫瘤的標(biāo)志物，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，且于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)CD36作為氧化磷脂受體與腫瘤干細(xì)胞的增殖相關(guān)。另一方面，腹膜含豐富的Ⅰ型膠原[8]，KENNY等[9]表明CD36作為Ⅰ型膠原受體，其表達(dá)抑制可降低Ⅰ型膠原基質(zhì)黏附力，對腫瘤盆腔或腹腔轉(zhuǎn)移尤為重要。有研究表明，CD36亦可作為脂肪酸受體結(jié)合游離脂肪酸（FFA）后通過激活Wnt/β-catenin和TGF-β信號途徑介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而更有利于肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[10]，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，在腎小管上皮細(xì)胞中，CD36的表達(dá)抑制可通過調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)，激活Smad 2和ERK 1/2信號途徑，抑制Fibronectin合成，從而減緩EMT[11]。LADANYI等[12]在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞可上調(diào)CD36表達(dá)，而CD36可降低卵巢癌細(xì)胞葡萄糖氧化過程形成低氧腫瘤細(xì)胞，低氧腫瘤細(xì)胞通過清除血清磷脂內(nèi)游離脂肪酸（FFA），使外源性脂肪酸通過CD36轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞，引起脂肪細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤生長、侵襲與轉(zhuǎn)移。PASCUAL等[13]研究表明，CD36作為脂肪酸受體可表達(dá)于人口腔癌細(xì)胞，該細(xì)胞在小鼠體內(nèi)具較高轉(zhuǎn)移潛能，且通過CD36抗體阻斷該受體后，小鼠體內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移情況明顯改善，原發(fā)腫瘤明顯萎縮甚至消失，表明CD36具有作為腫瘤靶向治療的潛能。

本實(shí)驗(yàn)研究采用Western blotting、免疫組織化學(xué)分別檢測CD36在宮頸癌細(xì)胞株、宮頸癌組織及癌旁正常宮頸上皮中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理因素的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD36在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，陽性率高達(dá)72.5%，而癌旁正常組織中CD36陽性率為僅為21.7%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blotting結(jié)果亦證實(shí)宮頸癌細(xì)胞株亦可表達(dá)CD36蛋白。免疫組織化學(xué)結(jié)果提示，與癌旁正常組織相比，宮頸癌組織中CD36表達(dá)明顯增高，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，CD36在宮頸癌中的表達(dá)與分化程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)關(guān)，初步證實(shí)CD36的表達(dá)與宮頸癌密切相關(guān)，這可能與CD36作為脂肪酸受體，通過不同信號途徑參與腫瘤的EMT，亦或作為其他受體參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。