楊柳，王穎潔，張莉，白雪梅

（大連醫(yī)科大學附屬二院 兒科，遼寧 大連 116027）

隨著新生兒存活率提高，新生兒腦損傷及其伴隨的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥成為兒科領域關注的重要問題[1-2]。關于其發(fā)病機制及治療方面的研究也較多。為探尋更有效控制和治療新生兒腦損傷的方法，提高腦損傷新生兒的生存率及改善其預后，本課題對新生大鼠腦損傷發(fā)生前后S100β蛋白表達的變化及重組人紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin,rhEPO）應用與否對S100β蛋白表達的影響進行比較，并在臨床觀察rhEPO應用對新生兒腦損傷的療效及對外周血S100β蛋白表達的影響，從而有機地將動物實驗與臨床實驗結合起來，進一步探討S100β蛋白在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中的意義；明確rhEPO對缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）新生大鼠S100β蛋白的調(diào)節(jié)作用及對新生兒腦損傷的治療價值，為rhEPO治療腦損傷提供理論依據(jù)，也為S100β蛋白對新生兒腦損傷的早期診斷、程度評估、療效及預后評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物實驗及分組處理

1.1.1 實驗動物 健康 2 日齡 SD 大鼠（清潔級，母鼠帶養(yǎng)）120只（P2），雌雄不限，體重8～15 g。

1.1.2 分組及處理 飼養(yǎng)至 7 日齡，隨機分成 3 組 ：假手術組、HIBD組和rhEPO組，每組40只。假手術組切開頸部皮膚，分離左頸總動脈后不予結扎，縫合切口后不做低氧處理。HIBD組和rhEPO組采用改良Rice法[3]復制HIBD模型，大鼠乙醚麻醉后，常規(guī)消毒切開頸部皮膚，分離并結扎左頸總動脈，縫合切口，待大鼠清醒后置于37℃恒溫水浴密閉缺氧艙中，以2 L/min流量向艙內(nèi)通入8%氧+92%氮混合氣體2 h。存活大鼠出現(xiàn)活動減少，間斷性抖動，鼻、耳部、四肢及尾部呈缺氧的青紫狀，呼吸加深加快，翻身能力、平衡能力及意識較差或存在障礙提示模型復制成功。rhEPO組在復制HIBD術后即刻腹腔注射rhEPO（北京四環(huán)生物制藥有限公司）5000u/（kg·次），假手術組及HIBD組復制模型后即刻給予腹腔注射等容積生理鹽水。

1.1.3 取樣及指標檢測 各組大鼠分別在出生后第3、5和7天及注射生理鹽水和rhEPO后6和24h，第3和7天斷尾取血，每次1ml，離心得血清標本，采用ELISA法檢驗血清中S100β蛋白表達水平。

1.2 臨床實驗

1.2.1 一般資料 選取2015年2月—2017年10月大連醫(yī)科大學附屬二院婦產(chǎn)科或新生兒科確診為腦損傷的新生兒25例（腦損傷組），其中輕度腦損傷15例，重度腦損傷10例；選擇同期出生的健康新生兒29例為對照組。腦損傷新生兒診斷：①出血性腦損傷：出血急性期MRI表現(xiàn)為T1WI無異?；蛏缘托盘?，T2WI呈高信號，亞急性期早期（即出血4～7d），T1WI呈高信號，T2WI稍低信號，慢性期（出血14d以后）T1WI和T2WI均為高信號。②缺血性腦損傷：局灶性缺血性腦損傷MRI表現(xiàn)為半卵圓中心、側(cè)腦室旁簇狀或線狀的短T1、短T2信號，DWI示受累腦組織明顯高信號；彌漫性缺血性損傷僅DWI表現(xiàn)為側(cè)腦室白質(zhì)大片狀高信號改變，神經(jīng)元軸突損傷表現(xiàn)為大腦皮層、丘腦、小腦、基底核、腦干部位DWI高信號。根據(jù)顱腦MRI結果并結合臨床確定診斷。本課題經(jīng)本院倫理委員會同意，與家長進行溝通簽署知情同意書，取得家長簽字的知情同意書。

1.2.2 納入與排除標準 納入標準 ：入院時日齡 7d新生兒，符合腦損傷的診斷標準。排除標準：并發(fā)宮內(nèi)TORCH感染，嚴重先天性畸形，先天性心臟病，遺傳代謝性疾病，母親為甲狀腺疾病患者。

1.3 治療方法

腦損傷的新生兒均給予皮下注射rhEPO（北京四環(huán)生物有限公司，國藥準字 S20083023），500u/（kg·次），3次/周，療程3～4周。

1.4 指標檢測

腦損傷組在應用rhEPO治療前和治療后第3、7和14天，分別留取外周靜脈血2ml，同一時間點取對照組血樣，將所有血樣進行離心處理，取血清，采用ELISA法測定血清S100β蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間不同時間點比較采用重復測量設計的方差分析檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠出生后不同時間的外周血S100β蛋白表達比較

3組大鼠出生后第3、5和7天外周血S100β蛋白表達比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的S100β蛋白表達無差異（F=0.374，P=0.689）；② 3組的 S100β 蛋白表達無差異（F=0.681，P=0.504）；③3組的S100β蛋白表達變化趨勢無差異（F=0.514，P=0.538）。見表1和圖1。

2.2 3組大鼠治療后不同時間的外周血S100β蛋白表達比較

3組大鼠治療后6和24h，第3和7天外周血S100β蛋白表達比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的S100β蛋白表達有差異（F=276.375，P=0.000）；② 3組的S100β蛋白表達有差異（F=238.175，P=0.000），rhEPO 組和 HIBD 組較假手術組高；③3組的S100β蛋白表達變化趨勢有差異（F=221.260，P=0.000）。見表2 和圖2。

表1 3組大鼠出生后不同時間的外周血S100β蛋白表達比較 （n=40，μg/L，±s）

表1 3組大鼠出生后不同時間的外周血S100β蛋白表達比較 （n=40，μg/L，±s）

組別 第3天 第5天 第7天假手術組 5.26±0.76 5.34±0.75 5.41±0.75 HIBD 組 5.39±0.72 5.32±0.74 5.39±0.74 rhEPO 組 5.28±0.69 5.27±0.70 5.37±0.69

圖1 3組大鼠出生后不同時間的外周血S100β蛋白表達比較 （n=40，±s）

表2 3組大鼠治療后不同時間的外周血S100β蛋白表達比較 （n=40，μg/L，±s）

表2 3組大鼠治療后不同時間的外周血S100β蛋白表達比較 （n=40，μg/L，±s）

組別 6 h 24 h 第3天 第7天假手術組 5.46±0.72 5.49±0.68 5.48±0.71 5.42±0.69 HIBD 組 10.29±1.06 9.72±1.02 10.56±1.36 9.05±1.21 rhEPO 組 8.34±0.96 7.11±0.89 9.01±1.15 6.51±0.99

圖2 各組大鼠治療后不同時間的外周血S100β蛋白表達比較 （n=40，±s）

2.3 兩組新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達比較

兩組新生兒治療前、治療后第3、7和14天外周血S100β蛋白表達比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的S100β蛋白表達有差異（F=4.085，P=0.000）；② 3 組 S100β 蛋白表達有差異（F=7.939，P=0.000），腦損傷組較對照組高 ；③ 3組S100β 蛋白表達變化趨勢有差異（F=2.123，P=0.044），腦損傷組外周血的S100β蛋白表達呈雙峰變化，見圖3和表3。

2.4 輕度和重度腦損傷新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達比較

3組治療前、治療后第3、7和14天外周血S100β蛋白表達比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的S100β蛋白表達有差異（F=12.771，P=0.000）；②3組S100β蛋白表達有差異（F=42.890，P=0.000），重度腦損傷組較其他兩組高；③3組S100β蛋白表達變化趨勢有差異（F=13.839，P=0.000），輕度和重度腦損傷新生兒組外周血的S100β蛋白表達呈雙峰變化。見表4和圖4。

圖3 兩組新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達比較 （±s）

表3 兩組新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達比較 （μg/L，±s）

表3 兩組新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達比較 （μg/L，±s）

組別 n 治療前治療后第3天 第7天 第14天對照組 29 5.32±1.03 5.39±1.09 5.28±1.11 5.19±1.15腦損傷組 25 13.24±3.68 7.26±2.17 9.15±2.34 6.13±2.04

表4 輕度和重度腦損傷新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達比較 （μg/L，±s）

表4 輕度和重度腦損傷新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達比較 （μg/L，±s）

組別 n 治療前治療后第3天 第7天 第14天對照組 29 5.32±1.03 5.39±1.09 5.28±1.11 5.19±1.15輕度腦損傷組 15 11.98±3.16 6.48±2.05 6.52±1.96 5.48±1.09重度腦損傷組 10 15.13±3.73 8.43±2.29 13.10±3.69 7.11±1.36

圖4 輕度和重度腦損傷新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達比較 （±s）

3 討論

隨著早產(chǎn)兒及重度缺氧缺血性腦病新生兒存活率提高，新生兒缺氧缺血性腦損傷及其伴隨的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥成為兒科領域關注的重要問題[4-6]。發(fā)病率有逐年上升的趨勢，關于其發(fā)病機制及治療方面的研究也較多。

S100β蛋白，作為中樞神經(jīng)特異蛋白，存在于神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細胞及少突細胞中，通過鈣離子信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)細胞代謝及信號傳遞[7-8]。發(fā)生腦損傷時過量的S100β蛋白刺激膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子、一氧化碳NO導致神經(jīng)元死亡。S100β蛋白是由膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，作用于神經(jīng)元及其周圍的環(huán)境，是神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元相互聯(lián)系的中介物質(zhì)之一，在腦的發(fā)育過程中和腦損傷時S100β蛋白是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，適量表達對腦組織起營養(yǎng)保護作用。神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達過量時，加速神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的惡化，并導致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。正常情況下，S100β蛋白不能通過血-腦屏障進入血液，但在一些病理情況下可檢測到血清S100β升高。發(fā)生腦損傷時過量的S100β蛋白刺激膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子、NO導致神經(jīng)元死亡。因此，有學者認為S100β蛋白是迄今最能反映腦損傷程度的特異性蛋白，由于S100β蛋白在腦損傷后有很好的時間變化規(guī)律，而且與腦損傷程度有緊密相關性，穩(wěn)定性又比其他神經(jīng)生化指標高，研究其在腦損傷后的動態(tài)規(guī)律變化，將能從分子水平細胞水平給腦損傷程度和治療效果提供依據(jù)[9-10]。本研究結果顯示，與對照組比較，不論出生第7天的HIBD新生鼠或第7天診斷為腦損傷的新生兒，外周血的S100β蛋白均增高，可見HIBD新生鼠或診斷為腦損傷的新生兒均存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的情況。

有文獻顯示，腦損傷大腦各部位的S100β表達呈雙峰變化，如皮質(zhì)部、海馬和丘腦均有雙峰的變化，雖然各部位雙峰出現(xiàn)時間略有差異，但趨勢相似，本結果顯示，HIBD組外周血S100β表達在第3和14天呈低值，給藥前和給藥第7天呈高值，與缺血再灌注的二次腦損傷相關，雙峰程度也與預后相關。病情較輕或預后良好的腦損傷新生兒在發(fā)病時S100β蛋白呈高表達，隨著治療時間延長，外周血S100β蛋白呈降低趨勢，病情較重或預后不佳患兒外周血S100β蛋白雙峰現(xiàn)象明顯，因此也有法醫(yī)報道將S100β蛋白水平作為生前傷及死后傷鑒別的主要指標，但本課題隨訪時間較短，病情較輕或預后良好的腦損傷新生兒也可能存在S100β蛋白的雙峰表達，而且新生兒的血腦屏障發(fā)育尚不成熟S100β蛋白的穿透性也較高，且S100β蛋白在不同的組織也有表達，致使腦損傷新生兒的S100β蛋白在外周血的表達更為復雜，因此有必要擴大樣本和延長時間檢測。

針對新生兒腦損傷神經(jīng)保護的研究雖然很多，但是目前尚無一種理想的藥物應用于臨床，因此，尋找新型高效的腦保護藥物以防治新生兒腦損傷是臨床上亟待解決的難題。本研究結果顯示，不論新生大鼠及新生兒腦損傷，給予rhEPO均可降低外周血S100β蛋白水平達到治療的目的。rhEPO是一種作用于造血細胞，促進紅細胞生成的糖蛋白[11-12]，rhEPO能參與rhEPO受體信號通路，以信號轉(zhuǎn)導分子的身份調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號的傳遞[13]。國內(nèi)外多項臨床研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，應用rhEPO能夠促進早產(chǎn)兒腦和神經(jīng)發(fā)育，減輕新生兒缺氧缺血性腦損傷時早期腦損害、促進后期神經(jīng)元及少突細胞的分化、抗神經(jīng)細胞凋亡等，新生動物或新生兒經(jīng)腹或皮下注射rhEPO能提高其神經(jīng)行為能力，rhEPO對心臟也具有良好的保護作用。腦卒中新生鼠實驗中，rhEPO可縮小雌性鼠腦梗死范圍，提高遠期神經(jīng)預后。rhEPO為神經(jīng)細胞的發(fā)育和存活提供了新途徑。在動物模型研究中已證實rhEPO可通過一系列廣泛的細胞信號傳導通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，抗神經(jīng)細胞凋亡是目前研究最深入的機制之一[16-17]。

綜上所述，S100β蛋白在新生大鼠及新生兒腦損傷可呈雙峰變化，其中輕度新生兒腦損傷的S100β蛋白無雙峰變化，rhEPO可用于治療新生大鼠及新生兒腦損傷。但是有關RHEPO對S100β蛋白的調(diào)節(jié)作用等方面的問題有待于進一步研究。