高素偉 張連海 趙新宇

（北京市通州區(qū)種子管理站，北京101117）

目前，北京市各區(qū)縣種子管理站通過田間小區(qū)種植來鑒定品種的真實性和純度，時效性較差，也無法提前避免農民遭受損失。SSR分子標記技術能夠對抽檢的樣品進行快速而準確的檢測，保證品種的真實性[1]。毛細管電泳主要應用于肽類、蛋白、核酸、離子和藥物等的分離和測定，是以高壓電場為動力，以毛細管為通道，依據樣品中分子量或堿基逐一分開[2]，可以同時對多個樣品、多個標記進行檢測，大大提高了檢測效率。因此，在現(xiàn)有條件下，利用SSR標記并結合毛細管電泳檢測技術對抽檢樣品進行品種真實性鑒定是提高各區(qū)縣種子站業(yè)務工作能力，確保種子市場安全的有效方法。

本文利用毛細管電泳熒光標記法對本轄區(qū)不同門店內抽取的6個玉米樣品進行檢測，初步判斷品種的真實性，對有疑問的樣品提交有資質的檢驗機構做進一步檢測。

1 材料與方法

1.1試驗材料供試材料為2017年3月份從轄區(qū)門店抽取的6份玉米樣品，1：金博士鄭單958；2：金娃娃鄭單 958；3：中字牌鄭單 958；4：德農鄭單 958；5：紀元1號；6：紀元1號。

1.2 基因組DNA的提取將抽檢的6個玉米樣品進行田間種植，在3葉期進行取樣，每個樣品取10個單株葉片，利用TIANGEN的新型植物基因組DNA提取試劑盒，按照操作規(guī)程提取DNA，并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3引物設計參照NY/T 1432-2014《玉米品種鑒定技術規(guī)程 SSR標記法》推薦的普通玉米真實性檢測基本核心引物P01～P20，分別為bnlg439w1、umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi053k2、phi072k4、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、phi065k9、umc1492y13、umc1432y6、umc1506k12，引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。其中，P14、P18、P11、P15、P20加ROX標記；P19、P02、P03、P13、P16加TAMRA標記；P09、P05、P01、P12、P10加HEX標記；P08、P17、P07、P06、P04加FAM標記。

1.3 熒光引物PCR擴增熒光引物PCR擴增體系：2×Mix 5μL，10μmol/L 的 F/R 0.1μL，DNA 原液 1μL，加 ddH2O 補足 10μL。熒光引物 PCR 擴增程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，Tm退火30s，72℃延伸 30s，35 個循環(huán)；72℃延伸 30min，4℃保存。根據引物退火溫度，判斷Tm值，其中P12和P13引物Tm值為55℃，其余18對引物Tm值為58℃。

1.4毛細管電泳上機檢測取PCR產物0.3μL、分子量內標（LIZ500）0.5μL和去離子甲酰胺 9.5μL混合加入PCR板中，95℃變性5min，4℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機檢測，使用DNA分析儀3500XL的片段分析軟件GeneMapper編寫panel，讀出每個樣品每個位點的等位基因擴增片段大小。當樣品間差異位點數(shù)≥2時，判定為不同；當樣品間差異位點數(shù)=1時，判定為近似；當樣品間差異位點數(shù)=0時，判定極近似或相同。

2 結果與分析

2.1 DNA完整性檢測結果利用瓊脂糖凝膠電泳檢測6個玉米樣品的基因組DNA（圖1），結果顯示所有條帶均為單一亮帶，并且完整、整齊、清楚，而且點樣孔清晰可見，沒有拖尾現(xiàn)象，表明6個樣品的基因組DNA質量較高，沒有降解，可以繼續(xù)下一步試驗。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測6個玉米樣品基因組DNA完整性的結果

2.2 DNA純度檢測通常用OD260/OD280比值來衡量樣品DNA純度，質量高的DNA，其OD260/OD280的比值在 1.8～2.0之間；OD260/OD280比值 <1.8，表明有蛋白質、酚污染；OD260/OD280比值>2.0，表明有RNA污染[3]。由表1可以看出，6個玉米樣品基因組DNA的OD260/OD280在2.0～2.2之間，有少量RNA污染，但毛細管電泳的標記是針對DNA設計的，特異性很高，而且RNA很容易降解，對PCR擴增結果不會有影響，因此可以對擴增產物稀釋后進行毛細管電泳上機檢測。

表1 6個玉米樣品基因組DNA純度檢測結果

2.3 毛細管電泳上機檢測結果1、2、3、4號樣品20個位點差異位點數(shù)=0，不存在差異，說明這4個樣品為同一個品種，不存在套牌。由圖2可知，5、6號樣品的19對核心引物（P05引物沒有擴增產物）擴增出來的電泳峰主峰明顯、雜峰較少、峰形整齊，分離效果較好，但在P03位點處存在差異，由此判斷這2個樣品為相似品種，但不能完全確定是否存在套牌[4]。

圖2 毛細管電泳檢測20對熒光引物在5、6號樣品基因組的擴增產物

3 討論

本試驗利用毛細管電泳熒光標記檢測技術，對從轄區(qū)門店抽檢的6個玉米樣品進行真實性鑒定，試驗結果顯示1、2、3、4號樣品在20個位點上不存在差異，說明從不同門店抽檢的樣品不存在套牌，為相同品種鄭單958，5號和6號樣品均為紀元1號，但在20個位點上存在1個差異位點，該檢測結果與所抽檢樣品不符，但不能完全確定是否存在套牌，為進一步確認可提交有資質的機構做進一步檢測[5]。這可能是同一個品種在長期栽培過程中存在自然變異，因此對育種者來說，保持親本的純度非常重要，在保存親本的過程中除了要從形態(tài)特征上鑒定外還要從分子水平進行鑒定，以確保生產的雜交種的真實性，保護育種者、生產者及農民的合法權益。