林慶煥 丁茸 畢婷婷 林健 鄧貴華

[摘要] 目的 研究ABT-263對(duì)順鉑耐藥食管癌細(xì)胞EC109/CDDP的作用。 方法 采用MTT法檢測(cè)ABT-263對(duì)耐藥細(xì)胞EC109/CDDDP及其親代細(xì)胞EC109的細(xì)胞毒作用;通過克隆存活實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ABT-263對(duì)食管癌細(xì)胞再生能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況，并通過Western blot檢測(cè)細(xì)胞PARP蛋白的變化。 結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ABT-263對(duì)EC109及EC109/CDDP的細(xì)胞活力均有顯著抑制作用;克隆存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ABT-263可以抑制食管癌細(xì)胞的再生能力（P < 0.01）;流式凋亡結(jié)果分析顯示ABT-263誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡（P < 0.01）;Western blot結(jié)果顯示ABT-263顯著上調(diào)細(xì)胞PARP蛋白的剪切（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 ABT-263抑制食管癌EC109/CDDP細(xì)胞及其親代細(xì)胞EC109的細(xì)胞活力和增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

[關(guān)鍵詞] ABT-263;食管癌;順鉑耐藥;凋亡

[中圖分類號(hào)] R730.23? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）01（b）-0012-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of ABT-263 on cisplatin-resistant esophageal cancer cell line of EC109/CDDP. Methods The cytotoxicity of ABT-263 in the cisplatin-resistant cell line EC109/CDDP and its parental cell line EC109 was measured by MTT assay. Colony formation assay was used to determine the effect of ABT-263 on cell renewable capacity of esophageal cancer cells. Flow cytometry was adopted to detect cell apoptosis. Western blot was used to investigate the changes of protein expression of PARP. Results MTT assay results showed that ABT-263 significantly inhibited the cell viability of EC109 and EC109/CDDP. Colony formation assay indicated that ABT-263 inhibited the cell renewable capacity of esophageal cancer cells （P < 0.01）. Flow cytometry analysis revealed that ABT-263 induced apoptosis of esophageal cancer cells （P < 0.01）. Western blot results showed that ABT-263 significantly increased the protein expression of cleavage PARP （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion ABT-263 exhibits cytostatic and cytotoxic effects on cisplatin-resistant esophageal cancer cell line EC109/CDDP and its parental cell line EC109， while it induces apoptosis.

[Key words] ABT-263; Esophageal cancer; Cisplatin-resistant; Apoptosis

食管癌作為最常見的八大癌癥，在全世界范圍內(nèi)增長(zhǎng)迅猛，患者死亡率高，而我國(guó)也是世界上食管癌最為高發(fā)的地區(qū)之一[1-3]。順鉑作為在腫瘤治療中應(yīng)用最廣泛有效的化療藥物之一，對(duì)包括食管癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤具有很好的治療效果[4]。但是，隨著腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性，對(duì)耐藥細(xì)胞的治療已經(jīng)成為新的挑戰(zhàn)[5]。ABT-263作為一種新型Bcl-2家族蛋白抑制劑，不僅能通過抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且對(duì)紫杉醇耐藥的前列腺癌細(xì)胞也有抑制作用[6-8]。本研究主要以ABT-263處理順鉑耐藥食管癌細(xì)胞EC109/CDDP及其親代細(xì)胞EC109，檢測(cè)藥物能否有效抑制細(xì)胞的增殖和再生及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，探討ABT-263對(duì)順鉑耐藥食管癌細(xì)胞的體外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人源食管鱗癌細(xì)胞株EC109來源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所（北京），順鉑耐藥細(xì)胞株EC109/CDDP來源于南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院[9]。ABT-263購(gòu)于美國(guó)Sellsck公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素/鏈霉素）、胰蛋白酶、蛋白Marker購(gòu)于美國(guó)Gibico公司;MTT、二甲基亞砜（DMSO）、蘇木精染料購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;PBS粉末購(gòu)于廣州展晨生物技術(shù)有限公司;RIPA蛋白裂解液、RIPA Lysis Buffer、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物Protease Inhibitor Cocktail購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;蛋白上樣緩沖液、LDS Sample buffer購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;PVDF膜購(gòu)于瑞士羅氏公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PARP抗體、β-actin抗體、二抗羊抗兔IgG購(gòu)于美國(guó)CST公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）于37℃、5%CO2環(huán)境下對(duì)食管癌細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行傳代處理。

1.3 MTT法檢測(cè)ABT-263對(duì)食管癌細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌細(xì)胞EC109和EC109/CDDP用胰蛋白酶進(jìn)行消化、離心并計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，取適量細(xì)胞懸液，以3000個(gè)/孔接種于96孔板中靜置過夜。分別加入0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的ABT-263處理細(xì)胞48 h后，換用含MTT（5 mg/mL）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除培養(yǎng)基并加入DMSO（150 μL/孔），振蕩后用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。計(jì)算各濃度組平均OD值，以0 μmol/L為對(duì)照，計(jì)算各孔OD值相對(duì)0 μmol/L濃度平均值的相對(duì)吸光率，以100%減去各孔相對(duì)吸光率計(jì)算抑制率并繪制抑制率曲線。

1.4 克隆存活實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ABT-263對(duì)食管癌細(xì)胞再生能力的影響

細(xì)胞接種于6孔板后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別加入1‰的DMSO（ABT-263 0 μmol/L）和10 μmol/L的ABT-263對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，離心并計(jì)數(shù)后以3000個(gè)/孔接種于6孔板中，將細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12～14 d，每2天更換一次培養(yǎng)基，直至克隆斑形成。去除培養(yǎng)基并用PBS溶液洗滌，接著用95%乙醇固定，最后用蘇木精染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并對(duì)克隆斑進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 Annexin V-FITC檢測(cè)ABT-263對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞接種于6孔板后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別加入1‰的DMSO和10 μmol/L的ABT-263處理細(xì)胞48 h。用不含EDTA的胰酶將細(xì)胞消化后收集于離心管中，1200 r/min離心5 min，用4℃預(yù)冷的PBS溶液清洗細(xì)胞;取3 mL的1×Binding buffer將細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)移至流式管中，離心后輕輕棄去上清液，每管用100 μL的1×Binding buffer將細(xì)胞重懸并加入5 μL的Annexin V-FITC染料，室溫下避光孵育15 min后再加入400 μL的1×Binding buffer并混勻，之后上機(jī)檢測(cè)，通過FlowJo 7.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析處理。

1.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP的變化

細(xì)胞接種后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別加入1‰的DMSO和10 μmol/L的ABT-263處理細(xì)胞48 h。之后將培養(yǎng)皿置于冰上，加入60 μL/皿的預(yù)冷RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）充分裂解后提取蛋白于預(yù)冷的1.5 mL EP管內(nèi)。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，依比例將蛋白樣品的濃度進(jìn)行歸一化后，100℃金屬浴加熱5 min。垂直電泳槽內(nèi)加入20 μL/孔的蛋白樣品，并對(duì)蛋白樣品進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h后，一抗4℃孵育過夜。取出PVDF膜在搖床上用1×TBST漂洗液清洗3次，每次10 min。之后對(duì)條帶二抗室溫孵育1 h，用1×TBST洗膜6次，每次5 min，加ECL發(fā)光液顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖表制作，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABT-263對(duì)EC109和EC109/CDDP細(xì)胞活力的影響

ABT-263處理能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞EC109和EC109/CDDP的細(xì)胞活力，且抑制作用具有濃度依賴性。其對(duì)EC109和EC109/CDDP細(xì)胞的IC50值分別為（10.47±0.30）μmol/L和（8.72±0.62）μmol/L。

2.2 ABT-263對(duì)EC109和EC109/CDDP細(xì)胞再生能力的影響

經(jīng)過ABT-263處理的食管癌細(xì)胞EC109和EC109/CDDP再生能力均受到明顯抑制。以對(duì)照組（ABT-263 0 μmol/L）克隆斑數(shù)目為100%，ABT-263處理后EC109和EC109/CDDP細(xì)胞的克隆斑數(shù)目分別為（68.53±3.73）%和（54.64±2.22）%。與對(duì)照組比較，EC109和EC109/CDDP細(xì)胞克隆斑數(shù)目均減少，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 7.95、23.92，均P < 0.01）。

2.3 ABT-263對(duì)EC109和EC109/CDDP細(xì)胞凋亡的影響

ABT-263處理食管癌細(xì)胞48 h后，實(shí)驗(yàn)組（ABT-263 10 μmol/L）細(xì)胞凋亡明顯多于對(duì)照組（ABT-263 0 μmol/L）[EC109：（9.79±0.84）%比（3.77±0.16）%;EC109/CDDP：（22.34±1.19）%比（9.73±0.16）%]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 9.93、14.88，均P < 0.01）。

2.4 ABT-263對(duì)EC109和EC109/CDDP細(xì)胞PARP蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組（ABT-263 0 μmol/L）比較，實(shí)驗(yàn)組（ABT-263 10 μmol/L）EC109及EC109/CDDP細(xì)胞PARP蛋白的剪切明顯上調(diào)（t = 9.71，P < 0.05;t = 16.87，P < 0.01）。

3 討論

食管癌主要分為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌兩大類。食管鱗癌在發(fā)展中國(guó)家中較為常見，其可能發(fā)生于整個(gè)食管部位，作為最致命且研究最少的癌癥之一，其長(zhǎng)期預(yù)后情況非常糟糕，總體5年生存率為15%～25%[10-11]。當(dāng)前食管癌的治療多采用多模式的治療方式，其中化療以及輔助性化療依然是最重要的手段之一，而順鉑在食管癌化療中占據(jù)著不可或缺的地位[11-13]。但是，化療中腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性仍然是順鉑化療所面臨的最大挑戰(zhàn)。

ABT-263能選擇性抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道ABT-263能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]，我們此前的研究也發(fā)現(xiàn)該藥物能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生G1/G0周期阻滯、凋亡和自噬[15]。為了進(jìn)一步探討ABT-263對(duì)順鉑耐藥食管癌細(xì)胞的作用，本研究采用ABT-263處理順鉑耐藥細(xì)胞EC109/CDDP及其親代細(xì)胞EC109并檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞再生能力以及細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ABT-263對(duì)食管癌親代細(xì)胞和順鉑耐藥細(xì)胞的細(xì)胞活力和再生能力均有顯著抑制作用，且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

順鉑主要通過與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合并導(dǎo)致其損傷從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，順鉑化療的過程中常受到其獲得性耐藥的限制。順鉑獲得性耐藥的主要機(jī)制包括減少藥物蓄積和增強(qiáng)藥物滅活、促進(jìn)DNA修復(fù)、抑制凋亡信號(hào)傳導(dǎo)和間接調(diào)控因子的改變等[16]。已有研究表明，自噬作為腫瘤細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制，抑制其作用能夠提高順鉑對(duì)耐藥食管癌細(xì)胞的抗腫瘤作用[17]。此外，C-末端結(jié)合蛋白-2和食管癌相關(guān)基因-2也能夠通過影響腫瘤細(xì)胞凋亡通路從而調(diào)節(jié)耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[18-19]。而銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1的表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)了順鉑誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞EC109耐藥[9]。本研究結(jié)果顯示ABT-263處理耐藥細(xì)胞EC109/CDDP能夠抑制細(xì)胞活力和再生能力，這很可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而完成。盡管發(fā)生凋亡的機(jī)制尚不明確，但是PARP蛋白剪切的上調(diào)提示caspase通路對(duì)其產(chǎn)生作用[15，20]。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，相同濃度的ABT-263處理食管癌細(xì)胞，耐藥細(xì)胞受到的抑制作用比親代細(xì)胞更強(qiáng)，顯示其對(duì)順鉑耐藥細(xì)胞的抑制優(yōu)勢(shì)。以上結(jié)果提示ABT-263或許能夠給順鉑耐藥食管癌的治療提供新的選擇和思路，其體內(nèi)抗癌活性及具體機(jī)制仍待進(jìn)一步的研究探討。

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（收稿日期：2018-07-29? 本文編輯：羅喬荔）