韋晟 劉金春 葛衛(wèi)紅

[摘要] 目的 探討黃連堿對(duì)過氧化氫（H2O2）損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法 將體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（EA.hy926）分為對(duì)照組、模型組、給藥組。對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，模型組給H2O2刺激4 h，給藥組用不同濃度的黃連堿（2.5、5、10、20、40 μmol/L）預(yù)處理4 h，再用H2O2刺激4 h。采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力，熒光探針-二氫乙啶（DHE）染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax的變化。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞凋亡率、caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)明顯升高（P < 0.01）;而與模型組比較，給藥組細(xì)胞的存活率和Bcl-2蛋白的表達(dá)均隨著給藥濃度的增加而逐漸升高，細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞凋亡率、caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)均隨著給藥濃度的增加而逐漸下降，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 黃連堿是通過抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞存活率降低、細(xì)胞內(nèi)ROS升高、細(xì)胞凋亡增多、caspase-3和Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)以及Bcl-2蛋白表達(dá)的下調(diào)，發(fā)揮其對(duì)H2O2損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，且呈劑量依賴性。

[關(guān)鍵詞] 黃連堿;EA.hy926細(xì)胞;氧化應(yīng)激;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R54? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）01（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the protective effect and mechanism of coptisine on vascular endothelial cells induced by hydrogen peroxide （H2O2）. Methods Human umbilical vein endothelial cells （EA.hy926） cultured in vitro were divided into control group， model group and drug administration group. The control group was added with fresh medium， and the model group was stimulated by H2O2 for 4 h. The drug-treated group was pretreated with different concentrations of coptisine （2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L） for 4 h， and then stimulated with H2O2 for 4 h. Cell viability was detected by MTS assay， intracellular reactive oxygen species （ROS） was detected by ROS fluorescent probe - dihydroethidine （DHE） staining， apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining， and Western blot was used to detect the changes of apoptosis-related proteins caspase-3， Bcl-2 and Bax. Results Compared with the control group， the cell viability and Bcl-2 protein levels of the model group were markedly decreased， whereas the ROS levels， apoptotic rate， caspase-3 and Bax protein levels were significantly increased （P < 0.01）. However， compared with the model group， the cell viability and Bcl-2 protein levels of dosing group were increased gradually with the increasing concentration of coptisine， while the ROS levels， apoptotic rate， caspase-3 and Bax protein levels were decreased gradually with the increasing concentration of coptisine （P < 0.01）. Conclusion Coptisine exerts its protective effect on vascular endothelial cells injured by H2O2 in a dose-dependent manner by inhibiting the decrease of survival rate， the increase of ROS， the increase of apoptotic rate， the up-regulation of caspase-3 and Bax protein expression and the down-regulation of Bcl-2 protein expression in EA.hy926 cells induced by H2O2.

[Key words] Coptisine; EA.hy926 cell; Oxidative stress; Apoptosis

心血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病[1]。血管內(nèi)皮功能障礙已成為多種心血管疾病的關(guān)鍵調(diào)控因素[2]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是誘發(fā)包括動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的多種心血管疾病的一個(gè)重要因素[3-4]。因此，尋找能夠?qū)够钚匝跻鸬难趸瘧?yīng)激和細(xì)胞凋亡、可治療動(dòng)脈粥樣硬化的自由基清除劑具有重要臨床意義。黃連堿是一種天然的原小檗堿型生物堿季銨鹽，存在于毛茛科和罌粟科的多種植物中[5]。黃連堿通過抗氧化、抑制RhoA/Rho激酶通路、抗心肌細(xì)胞凋亡和炎癥對(duì)心肌梗死的大鼠具有心肌保護(hù)作用[6-7]。然而，黃連堿的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制至今尚不清楚。本研究擬探討黃連堿對(duì)過氧化氫（H2O2）損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制，為黃連堿防治心血管疾病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

EA.hy926細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司;細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒MTS購自美國Promega公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司;DHE-ROS活性氧檢測(cè)試劑盒購自北京威格拉斯公司;黃連堿、H2O2購自美國Sigma公司;caspase-3、Bax、Bcl-2、Tubulin、辣根過氧化物酶二抗購自美國Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 MTS法檢測(cè)黃連堿對(duì)H2O2損傷的EA.hy926細(xì)胞存活率的影響? 取對(duì)數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞，按照每孔約5×103個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔;待其貼壁后，分為對(duì)照組、模型組和給藥組;對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，模型組給予250 μmol/L的H2O2刺激4 h，給藥組用不同濃度的黃連堿（2.5、5、10、20、40 μmol/L）預(yù)處理4 h，其后用H2O2刺激4 h;每孔加入20 μL的MTS溶液，繼續(xù)孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長測(cè)定各孔光密度值。

1.2.2 熒光探針-二氫乙啶（DHE）染色法檢測(cè)黃連堿對(duì)H2O2損傷的EA.hy926細(xì)胞內(nèi)ROS的影響? 取對(duì)數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞，按照每孔約1×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板中，每孔1 mL;細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組和模型組處理方法同“1.2.1”，給藥組用低、中、高濃度的黃連堿（5、10、20 μmol/L）預(yù)處理4 h，再用H2O2刺激4 h;按照DHE-ROS活性氧檢測(cè)試劑盒上的說明檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃連堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡的影響? 取對(duì)數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞，按照每孔約2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每孔1 mL，24 h后細(xì)胞貼壁，同上述實(shí)驗(yàn)分組和給藥處理后，收集細(xì)胞，并按照Annexin V-FITC/PI試劑盒上的說明檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)? 取對(duì)數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞，按照每孔約5×105個(gè)細(xì)胞接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，每皿3 mL，24 h后細(xì)胞貼壁，同上述實(shí)驗(yàn)分組和給藥處理后，收集細(xì)胞并裂解，于4℃、12 000 g條件下離心15 min，收集上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，制備12%分離膠、5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。5%的BSA封閉2 h后，caspase-3（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、微管蛋白（Tubulin，1∶5000）于4℃下孵育過夜。用TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h后，再用TBST洗膜3次，接下來電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色，并用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 黃連堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞存活率的影響

MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組的細(xì)胞存活率顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，2.5 μmol/L給藥組細(xì)胞存活率沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;5、10、20、40 μmol/L給藥組細(xì)胞存活率明顯升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.2 黃連堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

DHE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組中紅色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，提示細(xì)胞中ROS含量明顯升高;與模型組比較，給藥組紅色熒光強(qiáng)度隨著給藥濃度的增加逐漸減弱，提示細(xì)胞中ROS含量降低。

2.3 黃連堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組中細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與模型組比較，給藥組細(xì)胞凋亡率隨著給藥濃度的增加逐漸降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.4 Western blot檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量明顯增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與模型組比較，給藥組細(xì)胞內(nèi)caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)均隨著給藥濃度的增加而逐漸下調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平隨著給藥濃度的增加而逐漸上調(diào)，從而降低Bax/Bcl-2的比值，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化引起的心血管疾病嚴(yán)重危害著人類健康[8]。氧化應(yīng)激貫穿動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展及斑塊破裂觸發(fā)臨床事件的始終，被認(rèn)為是其致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[9-10]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體產(chǎn)生過量的ROS與清除ROS的抗氧化系統(tǒng)之間的失衡，導(dǎo)致體內(nèi)的ROS增多，并引起細(xì)胞氧化損傷的過程[11]。在培養(yǎng)基中添加H2O2引起的氧化損傷過程與體內(nèi)ROS誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的病理過程相類似[12]。因此，本研究采用H2O2體外誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞制備氧化應(yīng)激模型，觀察黃連堿對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。

本研究首先通過MTS法檢測(cè)不同濃度黃連堿對(duì)H2O2損傷的EA.hy926細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果表明，黃連堿能夠抑制H2O2導(dǎo)致的EA.hy926細(xì)胞氧化損傷，且在5～20 μmol/L呈明顯的濃度依賴性。DHE法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)黃連堿具有抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。

當(dāng)血管內(nèi)皮損傷或暴露于ROS時(shí)，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。通過Annexin V-FITC配合PI進(jìn)行雙染，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，可以用來區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞，并反映出細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[14]。本研究顯示，H2O2處理后細(xì)胞凋亡率明顯升高，其中尤以晚期凋亡為主，達(dá)到49.18%;黃連堿給藥組細(xì)胞凋亡率顯著降低，當(dāng)給藥濃度為20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率僅為4.54%，提示黃連堿在一定程度上能抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且呈良好的濃度依賴性。細(xì)胞的凋亡與抗凋亡間存在一種精細(xì)平衡，這種平衡一旦被打破，則可啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡程序[15]。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境刺激下啟動(dòng)的由基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過程，ROS能夠激活凋亡啟動(dòng)分子，從而促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]。在細(xì)胞凋亡過程中，caspase-3占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[17]。因此，caspase-3的激活常被為作為判斷細(xì)胞凋亡的可靠指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠使細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增加;黃連堿能顯著下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)。此外，caspase的活性在凋亡發(fā)展過程中也可被細(xì)胞內(nèi)眾多的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)，如Bcl-2家族蛋白分子[18]。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中Bax/Bcl-2的比例決定了細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)凋亡信號(hào)的敏感性[19-20]。本研究結(jié)果顯示，黃連堿呈濃度依賴性地抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞中Bax表達(dá)上調(diào)、Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，從而顯著降低Bax/Bcl-2的比值，最終抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究采用H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型考察黃連堿的抗氧化損傷作用。結(jié)果表明，黃連堿通過抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞存活率降低、細(xì)胞內(nèi)ROS升高、細(xì)胞凋亡增多、caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)以及Bcl-2蛋白表達(dá)的下調(diào)，從而發(fā)揮其對(duì)H2O2損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。因缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，本研究的結(jié)果具有一定的局限性，但本研究為黃連堿的進(jìn)一步開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-05-14? 本文編輯：王? ?蕾）